Hotstart Taq DNA -polymeraasi
Hot Start Taq DNA Polymerase (vasta-ainemodifikaatio) on kuumakäynnistetty lämpöstabiili DNA-polymeraasi Thermus aquaticus YT-1:stä, jolla on 5′→3′-polymeraasiaktiivisuutta ja 5' läppäendonukleaasiaktiivisuutta.Kuumakäynnistys Taq-DNA-polymeraasi on Taq-DNA-polymeraasi, joka on modifioitu lämpölabiileilla Taq-vasta-aineilla.Vasta-aineen modifiointi lisäsi PCR:n spesifisyyttä, herkkyyttä ja saantoa.
Komponentit
| Komponentti | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5 × HC Taq -puskuri | 4 x 1 ml | 4 × 10 ml | 4 × 50 ml | 5 × 400 ml |
| Hot Start Taq DNA -polymeraasi (vasta-ainemuunnettu) (5 U/μl) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10 × 5 ml |
Sovellukset
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 25 °C:ssa), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitolia, 0,5 % Tween20, 0,5 % IGEPALCA-630 ja 50 % glyseroli.
Säilytysolosuhteet
Kuljetus alle 0°C ja säilytettävä -25°C ~ -15°C.
Yksikön määritelmä
Yksi yksikkö määritellään entsyymimääräksi, joka sisällyttää 15 nmol dNTP:tä happoon liukenemattomaan materiaaliin 30 minuutissa 75 °C:ssa.
Laadunvalvonta
1.Endonnukleaasiaktiivisuus:Inkuboitiin 20 U entsyymiä 4 μg:n pUC19 DNA:n kanssa 4 tunnin ajan 37 °C:ssa, mikä ei johtanut havaittavaan DNA:n hajoamiseen geelielektroforeesilla määritettynä.
2.5 kb Lambda PCR:25 sykliä 5 ng:n lambda-DNA:n PCR-amplifikaatiosta 1,25 yksiköllä Taq DNA-polymeraasia 200 uM dNTP:n ja 0,2 uM alukkeiden läsnä ollessa tuottaa odotetun 5 kb:n tuotteen.
3.Eksonukleaasiaktiivisuus:50 µl:n reaktiota, joka sisältää vähintään 12,5 U Taq-DNA-polymeraasia 10 nmol:n 5'-FAM-oligonukleotidin kanssa, inkubointi 30 minuuttia 37 ℃:ssä ei tuota havaittavaa hajoamista.
4.RNase-aktiivisuus:10 µl:n reaktiota, joka sisälsi 20 U entsyymiä, inkubointi 1 µg:n RNA-transkriptien kanssa 2 tunnin ajan 37 °C:ssa ei johtanut havaittavaan RNA:n hajoamiseen geelielektroforeesilla määritettynä.
5.Lämmön poisto:Ei.
Reaktiojärjestelmä
| Komponentit | Äänenvoimakkuus |
| Malli-DNAa | valinnainen |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 µl |
| 10 μM Reverse Primer | 0,5 µl |
| dNTP-sekoitus (10 mM kukin) | 0,5 µl |
| 5 × HC Taq -puskuri | 5 μl |
| Taq DNA -polymeraasib(5U/μl) | 0,125 µl |
| Nukleaasiton vesi | Jopa 25 μl |
Huomautuksia:
1) a.
| DNA | Määrä |
| Genominen | 1 ng-1 μg |
| Plasmidi tai virus | 1 pg-1 ng |
2) b.Taq DNA-polymeraasin optimaalinen pitoisuus voi vaihdella välillä 5-50 yksikköä/ml (0,1-0,5 yksikköä/25 µL reaktio) erikoissovelluksissa.
Lämpöpyöräilyprotokolla
PCR
| Vaihe | Lämpötila(°C) | Aika | Pyörät |
| Alkudenaturaatioa | 95 ℃ | 1-3 minuuttia | - |
| Denaturaatio | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 sykliä |
| Hehkutusb | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Laajennus | 68 ℃ | 1 kb/min | |
| Lopullinen laajennus | 68 ℃ | 5 minuuttia | - |
Huomautuksia:
1) Alkudenaturaatio 1 minuutti 95 °C:ssa riittää useimpiin amplifikaatioihin.Vaikeiden mallien kohdalla suositellaan pidempää 2-3 minuutin denaturaatiota 95 °C:ssa.Pesäkkeiden PCR:ssä suositellaan 5 minuutin denaturaatiota 95 °C:ssa.
2) Hehkutusvaihe on tyypillisesti 15-60 s.Hehkutuslämpötila perustuu alukeparin Tm:ään ja on tyypillisesti 45-68 ℃.
