Rnaasin estäjä
Hiiren RNaasi-inhibiittori on rekombinantti hiiren RNaasi-inhibiittori, joka on ekspressoitu ja puhdistettu E. colista.Se sitoutuu RNaasi A:seen, B:hen tai C:hen suhteessa 1:1 ei-kovalenttisella sidoksella, mikä estää kolmen entsyymin aktiivisuutta ja suojaa RNA:ta hajoamiselta.Se ei kuitenkaan ole tehokas Aspergilluksen RNaasi 1:tä, RNaasi T1:tä, S1-nukleaasia, RNaasi H:ta tai RNaasia vastaan.Hiiren RNaasi-inhibiittori testattiin RT-PCR:llä, RT-qPCR:llä ja IVT-mRNA:lla, ja se oli yhteensopiva useiden kaupallisten käänteistranskriptaasien, DNA-polymeraasien ja RNA-polymeraasien kanssa.
Verrattuna ihmisen RNaasi-inhibiittoreihin, hiiren RNaasi-inhibiittori ei sisällä kahta kysteiiniä, jotka ovat erittäin herkkiä hapettumiselle, joka aiheuttaa inhibiittorin inaktivoitumisen.Tämä tekee siitä vakaan pienillä DTT-pitoisuuksilla (alle 1 mM).Tämä ominaisuus tekee siitä sopivan käytettäväksi reaktioissa, joissa suuret DTT-pitoisuudet ovat haitallisia reaktiolle (esim. reaaliaikainen RT-PCR).
Asovellus
Tätä tuotetta voidaan käyttää laajalti kaikissa kokeissa, joissa RNaasi-interferenssi on mahdollista RNA:n hajoamisen välttämiseksi, kuten:
1.cDNA:n ensimmäisen juosteen synteesi, RT-PCR, RT-qPCR jne.
2.Suojaa RNA:ta hajoamiselta in vitro -transkription/transloinnin aikana (esim. in vitro virusreplikaatiojärjestelmä).
3.RNaasi-aktiivisuuden estäminen RNA:n erotuksen ja puhdistuksen aikana.
Varastointiolosuhteet
Tuote säilyy -25～- 15 ℃ lämpötilassa, voimassa 2 vuotta.
Tallennuspuskuri
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT ja 50 % glyseroli.
Yksikön määritelmä
Hiiren RNaasi-inhibiittorin määrä, joka tarvitaan estämään 5 ng:n ribonukleaasi A:n aktiivisuus 50 %:lla, määriteltiin yhdeksi yksiköksi (U).
Proteiinin molekyylipaino
Hiiren RNaasi-inhibiittorin molekyylipaino on 50 kDa.
Laadunvalvonta
Eksonukleaasi Toiminta:
40 U hiiren RNaasi-inhibiittoria 1 μg:lla λ-Hind III -digesti-DNA:ta 37 °C:ssa 16 tunnin ajan ei tuota hajoamista agaroosigeelielektroforeesilla määritettynä.
Endonukleaasiaktiivisuus:
40 U hiiren RNaasi-inhibiittoria ja 1 µg λ DNA:ta 37 °C:ssa 16 tunnin ajan ei tuota hajoamista agaroosigeelielektroforeesilla määritettynä.
Nikkiminen Toiminta:
40 U hiiren RNaasi-inhibiittoria 1 µg:lla pBR322:ta 37 °C:ssa 16 tunnin ajan ei tuota hajoamista agaroosigeelielektroforeesilla määritettynä.
RNaasi Toiminta:
40 U hiiren RNaasi-inhibiittoria ja 1,6 µg MS2 RNA:ta 4 tunnin ajan 37 °C:ssa ei tuota hajoamista agaroosigeelielektroforeesilla määritettynä.
E.colin DNA:
40 U hiiren RNaasi-inhibiittoria seulotaan E. colin genomisen DNA:n läsnäolon suhteen käyttämällä TaqMan qPCR:ää E. coli 16S rRNA-lokukselle spesifisten alukkeiden kanssa.E. colin genominen DNA:n kontaminaatio on ≤ 0,1 pg/40 U.
Nhuoms
1. Voimakas värähtely tai sekoitus johtaa entsyymien inaktivoitumiseen.
2. Tämän inhibiittorin optimaalinen lämpötila-alue oli 25-55 ℃, ja se inaktivoitiin 65 ℃:ssa ja sitä korkeammassa lämpötilassa.
3. Hiiren RNaasi-inhibiittori ei estänyt RNaasi H:n, RNaasi 1:n ja RNaasi T1:n aktiivisuutta.
4. RNaasi-aktiivisuuden esto havaittiin laajalla pH-alueella (pH 5-9 olivat kaikki aktiivisia), ja suurin aktiivisuus havaittiin pH:ssa 7-8.
5. Koska ribonukleaasit säilyttävät tyypillisesti aktiivisuutensa denaturoivissa olosuhteissa, on varottava denaturoimasta RNaasi-inhibiittorimolekyylejä, jotka ovat kompleksoituneet ribonukleaasin kanssa.Aktiivisen ribonukleaasin vapautumisen estämiseksi yli 50 °C lämpötiloja ja suuria urean tai muiden denaturoivien aineiden pitoisuuksia tulee välttää.
