Urasiili DNA:n glykosylaasi
Urasiili-DNA-glykosylaasi (UNG tai UDG) on E. colin rekombinanttinen klooni, jonka molekyylipaino on 25 kDa.Se katalysoi vapaan urasiilin vapautumista urasiilia sisältävästä yksijuosteisesta ja kaksijuosteisesta DNA:sta, ja se on inaktiivinen RNA:ta vastaan, ja sitä voidaan käyttää estämään PCR-monistustuotteiden kontaminaatio.Toimintaperiaate perustuu siihen, että jos dUTP korvataan dTTP:llä PCR-reaktiossa ja muodostuu dU-emäksiä sisältävä PCR-monistustuote, entsyymi voi selektiivisesti katkaista U-emästen glykosidisidoksen yksijuosteisissa ja kaksijuosteisissa. DNA ja hajottaa PCR-monistustuote.
Suositeltu sovellus
Kontaminaation ehkäisy, vahvistus
Säilytysolosuhteet
-20°C pitkäaikaista varastointia varten, sekoita hyvin ennen käyttöä, vältä toistuvaa jäätymistä ja sulattamista.
Tallennuspuskuri
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilointiaine, 50 % glyseroli.
Yksikön määritelmä
Entsyymimäärä, joka tarvitaan hajottamaan 1 ug yksijuosteista DNA:ta, joka sisältää dU-emäksiä 1 tunnissa 37 °C:ssa, on 1 yksikkö.
Laadunvalvonta
1.SDS-PAGE elektroforeettinen puhtaus yli 98 %
2.Vahvistusherkkyys, erä-eräohjaus, vakaus
3.Kun 1 U UNG:ta on käsitelty 50 ℃:ssa 2 minuutin ajan, mallin, joka sisältää U:ta alle 103 kopiota, pitäisi hajota kokonaan, eikä vahvistustuotetta voida tuottaa
4.Ei eksogeenistä nukleaasiaktiivisuutta
Ohjeet
| Komponentit | Tilavuus (μL) | Lopullinen keskittyminen |
| 10 × PCR-puskuri (dNTP-vapaa, Mg²+vapaa) | 5 | 1× |
| dUTP:t (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 µM |
| dUTP (korvaa dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μl | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Sapluuna | - | ＜1μg/reaktio |
| ddH2O | 50:een | - |
Huomautus: a: Jos sitä käytetään qPCR/qRT-PCR:ään, fluoresoiva koetin tulee lisätä reaktiojärjestelmään.Yleensä 0,2 μM:n lopullinen alukepitoisuus voi antaa hyviä tuloksia;kun reaktion suorituskyky on huono, alukkeen konsentraatiota voidaan säätää välillä 0,2-1 µM.Yleensä koettimen pitoisuus optimoidaan välillä 0,1-0,3 μM.Konsentraatiogradienttikokeita voidaan suorittaa parhaan alukkeen ja koettimen yhdistelmän löytämiseksi.
Huomautuksia
1.UNG-entsyymiä voidaan käyttää poistamaan kontaminoituneet dUTP-monistustuotteet reaktiojärjestelmästä ennen PCR-amplifikaatioreaktiota, jotta vältetään tuotteen kontaminaatiosta johtuvat väärät positiiviset tulokset.
2.Optimaalinen lämpötila UNG-entsyymille käytettäväksi antikontaminaation PCR-reaktiossa on yleensä 50 ℃ 2 minuutin ajan;inaktivointitila on 95 ℃ 5 minuutin ajan.
3.Vältä toistuvaa jäätymistä ja sulattamista, äläkä altista suurille lämpötilanvaihteluille.
4.Eri monistettavilla geeneillä on erilainen dUTP:n hyötysuhde ja herkkyys UNG-entsyymille, joten jos UNG-järjestelmän käyttö johtaa havaitsemisherkkyyden heikkenemiseen, reaktiojärjestelmää tulee säätää ja optimoida, jos tarvitset teknistä tukea, ota yhteyttä yrityksemme.
