Villi Taq DNA -polymeraasi
Taq DNA Polymerase on Thermus aquaticus YT-1:n lämpöstabiili DNA-polymeraasi, jolla on 5'→3'-polymeraasiaktiivisuutta ja 5' läppäendonukleaasiaktiivisuutta.
Komponentit
| Komponentti | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10× Taq-puskuri | 2 × 1 ml | 2 × 10 ml | 2 × 50 ml | 5 × 200 ml |
| Taq DNA -polymeraasi (5 U/μl) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 5 × 10 ml |
Säilytysolosuhteet
Kuljetus alle 0°C ja säilytettävä -25°C ~ -15°C.
Yksikön määritelmä
Yksi yksikkö määritellään entsyymimääräksi, joka sisällyttää 15 nmol dNTP:tä happoon liukenemattomaan materiaaliin 30 minuutissa 75 °C:ssa.
Laadunvalvonta
1.Proteiinin puhtausmääritys (SDS-PAGE):Taq DNA-polymeraasin puhtaus määritettiin SDS-PAGE-analyysillä >95 %.
2.Endonnukleaasiaktiivisuus:Vähintään 5 U Taq DNA -polymeraasia ja 1 μg λDNA:ta 16 tunnin ajan 37 ℃:n lämpötilassa ei aiheuta havaittavaa hajoamista määritettynä.
3.Eksonukleaasiaktiivisuus:Vähintään 5 U Taq-DNA-polymeraasia ja 1 µg λ-HindⅢ-digesti-DNA:ta 16 tunnin ajan 37 ℃:ssa ei aiheuta havaittavaa hajoamista määritettynä.
4.Nickase-toiminta:Vähintään 5 U Taq DNA -polymeraasia ja 1 μg pBR322 DNA:ta 16 tunnin ajan 37 °C:ssa ei aiheuta havaittavaa hajoamista määritettynä.
5.RNase-aktiivisuus:Vähintään 5 U Taq DNA -polymeraasia ja 1,6 μg MS2 RNA:ta 16 tunnin ajan 37 °C:ssa ei aiheuta havaittavaa hajoamista määritettynä.
6.E. coliDNA:5 U Taq DNA -polymeraasia seulotaan E. colin genomisen DNA:n läsnäolon suhteen käyttämällä TaqMan qPCR:ää E. coli 16S rRNA-lokukselle spesifisten alukkeiden kanssa.E. colin genominen DNA:n kontaminaatio on ≤1 kopio.
7.PCR-monistus (5,0 kb:n lambda-DNA)- 50 µl:n reaktio, joka sisältää 5 ng lambda-DNA:ta ja 5 yksikköä Taq DNA -polymeraasia 25 PCR-monistussykliä varten, tuottaa odotetun 5,0 kb:n tuotteen.
Reaktion asetukset
| Komponentit | Äänenvoimakkuus |
| Malli-DNAa | valinnainen |
| 10 μM Forward Primer | 1 μl |
| 10 μM Reverse Primer | 1 μl |
| dNTP-sekoitus (10 mM kukin) | 1 μl |
| 10 × Taq-puskuri | 5 μl |
| Taq DNA -polymeraasib | 0,25 µl |
| Nukleaasiton vesi | Jopa 50 μl |
Huomautuksia:
1) Eri templaattien optimaalinen reaktiopitoisuus on erilainen.Seuraava taulukko näyttää suositellun mallin käytön 50 µl:n reaktiojärjestelmälle.
| DNA | Määrä |
| Genominen | 1 ng-1 μg |
| Plasmidi tai virus | 1 pg-1 ng |
2) Taq DNA -polymeraasin optimaalinen pitoisuus voi vaihdella välillä 0,25 µl - 1 µL erikoissovelluksissa.
ReaktioOhjelmoida
| Vaihe | Lämpötila(°C) | Aika | Pyörät |
| Alkudenaturaatioa | 95 ℃ | 5 minuuttia | - |
| Denaturaatio | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 sykliä |
| Hehkutusb | 60 ℃ | 15 s | |
| Laajennus | 72 ℃ | 1 kb/min | |
| Lopullinen laajennus | 72 ℃ | 5 minuuttia | - |
Huomautuksia:
1) Alkudenaturaatioolosuhteet sopivat useimpiin amplifikaatioreaktioihin ja niitä voidaan muokata templaattirakenteen monimutkaisuuden mukaan.Jos mallin rakenne on monimutkainen, esidenaturointiaikaa voidaan pidentää 5–10 minuuttiin alkuperäisen denaturaatiovaikutuksen parantamiseksi.
2) Hehkutuslämpötilaa on säädettävä alukkeen Tm-arvon mukaan, joka on yleensä asetettu 3-5 ℃ alemmaksi kuin alukkeen Tm-arvo;Monimutkaisten mallien kohdalla on tarpeen säätää hehkutuslämpötilaa ja pidentää pidennysaikaa tehokkaan vahvistuksen saavuttamiseksi.
