Proteinaasi K mNGS (neste)
Proteinaasi K on stabiili seriiniproteaasi, jolla on laaja substraattispesifisyys.Se hajottaa monia proteiineja natiivitilassa jopa pesuaineiden läsnä ollessa.Kide- ja molekyylirakennetutkimuksista saadut todisteet osoittavat, että entsyymi kuuluu subtilisiinien perheeseen, jossa on aktiivisen kohdan katalyyttinen triadi (Asp39-Hänen69-Ser224).Vallitseva katkaisukohta on peptidisidos, joka on alifaattisten ja aromaattisten aminohappojen karboksyyliryhmän vieressä estettyjen alfa-aminoryhmien kanssa.Sitä käytetään yleisesti sen laajan spesifisyyden vuoksi.Tämä proteinaasi K on erityisesti suunniteltu mNGS:lle.Verrattuna toiseen proteinaasi K:hen, se sisältää vielä vähemmän nukleiinihappokontaminaatiota samalla entsymaattisella suorituskyvyllä, mikä voisi paremmin varmistaa myöhemmän mNGS-sovelluksen.
Varastointiolosuhteet
2-8℃ 2 vuotta
Erittely
| Ulkomuoto | Väritön tai vaaleanruskea neste |
| Toiminta | ≥800 U/ml |
| Proteiinipitoisuus | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Ei havaittu |
| DNAase | Ei havaittu |
| RNaasi | Ei havaittu |
Ominaisuudet
| EY-numero | 3.4.21.64(Rekombinantti Tritirachium-albumista) |
| Isoelektrinen piste | 7.81 |
| Optimaalinen pH | 7,0-12,0 Kuva 1 |
| Optimaalinen lämpötila | 65 ℃ Kuva 2 |
| pH-stabiilisuus | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Kuva 3 |
| Lämpöstabiilisuus | Alle 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Kuva 4 |
| Varastoinnin vakaus | Yli 90 % aktiivisuutta 12 kuukauden ajan 25 ℃:ssa |
| Aktivaattorit | SDS, urea |
| Inhibiittorit | di-isopropyylifluorifosfaatti;fenyylimetyylisulfonyylifluoridi |
Sovellukset
1. Geneettinen diagnostiikkasarja
2. RNA- ja DNA-uuttosarjat
3. Muiden kuin proteiinikomponenttien uuttaminen kudoksista, proteiiniepäpuhtauksien, kuten DNA:n, hajottaminenrokotteet ja hepariinin valmistus
4. Kromosomi-DNA:n valmistus pulssielektroforeesilla
5. Western blot
6. Entsymaattiset glykosyloidut albumiinireagenssit in vitro -diagnoosi
Varotoimenpiteet
Käytä suojakäsineitä ja -laseja käytön tai punnituksen aikana ja pidä hyvä tuuletus käytön jälkeen.Tämä tuote voi aiheuttaa ihoallergisen reaktion ja vakavan silmien ärsytyksen.Hengitettynä se voi aiheuttaa allergia- tai astmaoireita tai hengenahdistusta.Saattaa aiheuttaa hengitysteiden ärsytystä.
Yksikön määritelmä
Yksi yksikkö (U) määritellään entsyymimääräksi, joka tarvitaan kaseiinin hydrolysoimiseen 1 μmolin tuottamiseksityrosiinia minuutissa seuraavissa olosuhteissa.
Reagenssien valmistus
Reagenssi I: 1 g maitokeiiniä liuotettiin 50 ml:aan 0,1 M natriumfosfaattiliuosta (pH 8,0), inkuboitiin 65-70 ℃ vedessä 15 minuuttia, sekoitettiin ja liuotettiin, jäähdytettiin vedellä, säädettiin natriumhydroksidilla pH-arvoon 8,0 ja kiinteä tilavuus 100 ml.
Reagenssi II: 0,1 M trikloorietikkahappo, 0,2 M natriumasetaatti, 0,3 M etikkahappo.
Reagenssi III: 0,4 M Na2CO3ratkaisu.
Reagenssi IV: Fornt-reagenssi laimennettuna puhtaalla vedellä 5 kertaa.
Reagenssi V: Entsyymilaimennusaine: 0,1 M natriumfosfaattiliuos (pH 8,0).
Reagenssi VI: tyrosiiniliuos: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrosiinia liuotettuna 0,2M HCl.
Menettely
1. 0,5 ml reagenssia I esilämmitetään 37 ℃:seen, lisätään 0,5 ml entsyymiliuosta, sekoitetaan hyvin ja inkuboidaan37 ℃ 10 minuuttia.
2. Lisää 1 ml reagenssia II reaktion pysäyttämiseksi, sekoita hyvin ja jatka inkubointia 30 minuuttia.
3. Sentrifugoi reaktioliuos.
4. Ota 0,5 ml supernatanttia, lisää 2,5 ml reagenssia III, 0,5 ml reagenssia IV, sekoita hyvin ja inkuboi 37 ℃:ssa.30 minuutiksi.
5. OD660määritettiin OD:ksi1;nollakontrolliryhmä: 0,5 ml reagenssia V käytetään korvaamaan entsyymiratkaisu OD:n määrittämiseen660kuten OD2, ΔOD = OD1-OD2.
6. L-tyrosiinin standardikäyrä: 0,5 ml eri konsentraatio L-tyrosiiniliuosta, 2,5 ml reagenssia III, 0,5 ml reagenssia IV 5 ml:n sentrifugiputkessa, inkuboi 37 ℃:ssa 30 minuuttia, havaitse OD660L-tyrosiinin eri konsentraatioille saatiin sitten standardikäyrä Y=kX+b, jossa Y on L-tyrosiinipitoisuus, X on OD600.
Laskeminen
2: Reaktioliuoksen kokonaistilavuus (ml)
0,5: Entsyymiliuoksen tilavuus (ml)
0,5: Kromogeenisessa määrityksessä käytetty reaktionesteen tilavuus (ml)
10: Reaktioaika (min)
Df: Laimennuskerroin
C: Entsyymipitoisuus (mg/ml)
Viitteet
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et ai.,euroaJ. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. painos, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Kuvat
Kuva.1 Optimaalinen pH
100 mM puskuriliuos: pH 6,0 - 8,0, Na-fosfaatti;pH 8,0 - 9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, glysiini-NaOH. Entsyymipitoisuus: 1 mg/ml
Kuva 2 Optimaalinen lämpötila
Reaktio 20 mM K-fosfaattipuskurissa pH 8,0.Entsyymipitoisuus: 1 mg/ml
Kuva 3 pH Vakaus
25 ℃, 16 h-käsittely 50 mM puskuriliuoksella: pH 4,5-5,5, asetaatti;pH 6,0-8,0, Na-fosfaatti;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0 - 12,5, glysiini-NaOH.Entsyymipitoisuus: 1 mg/ml
Kuva 4 Lämpö vakautta
30 min käsittely 50 mM Tris-HCl-puskurilla, pH 8,0.Entsyymipitoisuus: 1 mg/ml
Kuva 5 Varastointi stability at 25℃
