Proteinase K NGS (jauhe)
Luettelonumero: HC4507A
NGS Proteaasi K on vakaa seriiniproteaasi, jolla on korkea entsyymiaktiivisuus ja laaja substraattispesifisyys. Entsyymi hajottaa ensisijaisesti esterisidoksia ja peptidisidoksia hydrofobisten aminohappojen, rikkiä sisältävien aminohappojen ja aromaattisten aminohappojen C-pään vieressä.Joten sitä käytetään usein proteiinien hajottamiseen lyhyiksi peptideiksi.NGS-proteaasi K on tyypillinen seriiniproteaasi, jossa on Asp39-Hänen69-Ser224katalyyttinen triadi, joka on ainutlaatuinen seriiniproteaaseille, ja katalyyttistä keskustaa ympäröi touvi Ca2+sitoutumiskohtia stabilointia varten, säilyttäen korkea entsyymiaktiivisuus laajemmissa olosuhteissa.
Erittely
| Ulkomuoto | Valkoinen tai luonnonvalkoinen amorfinen jauhe, lyofilisoitu |
| Erityinen toiminta | ≥40 U/mg kiinteää ainetta |
| DNAase | Ei havaittu |
| RNaasi | Ei havaittu |
| Bioburden | ≤50 CFU/g kiinteää ainetta |
| Nukleiinihappojäännös | <5pg/mg kiinteää |
Ominaisuudet
| Lähde | Tritirachium albumi |
| EY-numero | 3.4.21.64(Rekombinantti Tritirachium-albumista) |
| Molekyylipaino | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektrinen piste | 7.81 Kuva 1 |
| Optimaalinen pH | 7,0-12,0 (Kaikki suorittavat korkeaa aktiivisuutta) Kuva 2 |
| Optimaalinen lämpötila | 65℃ Kuva 3 |
| pH Stabiilisuus | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Kuva 4 |
| Lämpöstabiilisuus | Alle 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Kuva 5 |
| Varastoinnin vakaus | Säilytetty 25 ℃ 12 kuukautta Kuva 6 |
| Aktivaattorit | SDS, urea |
| Inhibiittorit | di-isopropyylifluorifosfaatti;bentsyylisulfonyylifluoridi |
Varastointiolosuhteet
Säilytä lyofilisoitua jauhetta -25 ~ -15 ℃:ssa pitkään valolta suojassa;Liuotuksen jälkeen jaetaan sopivaan tilavuuteen lyhytaikaista varastointia varten 2-8 ℃:n lämpötilassa valolta suojassa tai pitkäaikaista varastointia -25--15 ℃:ssa valolta suojattuna.
Varotoimenpiteet
Käytä suojakäsineitä ja -laseja käytön tai punnituksen aikana ja pidä hyvä tuuletus käytön jälkeen.Tämä tuote voi aiheuttaa ihoallergisen reaktion ja vakavan silmien ärsytyksen.Hengitettynä se voi aiheuttaa allergia- tai astmaoireita tai hengenahdistusta.Saattaa aiheuttaa hengitysteiden ärsytystä.
Yksikön määritelmä
Yksi NGS-proteaasi K:n yksikkö määritellään entsyymimääräksi, joka tarvitaan kaseiinin hydrolysoimiseen 1 μmol L-tyrosiiniksi normaaleissa määritysolosuhteissa.
Reagenssien valmistus
| Reagenssi | Valmistaja | Luettelo |
| Tekninen kaseiininaudan maidosta | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| Ei2PO4· 2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trikloorietikkahappo | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natriumasetaattia | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Etikkahappo | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Sooda | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Foliini-fenoli | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tyrosiini | Sigma | 93829 |
Reagenssi I:
Substraatti: 1 % kaseiinia naudan maitoliuoksesta: liuotetaan 1 g naudan maidon kaseiinia 50 ml:aan 0,1 M natriumfosfaattiliuosta, pH 8,0, kuumennetaan vesihauteessa 65-70 °C:ssa 15 minuuttia, sekoitetaan ja liuotetaan, jäähdytetään vedellä, säädetään natriumhydroksidi pH-arvoon 8,0 ja laimenna 100 ml:ksi.
Reagenssi II:
TCA-liuos: 0,1 M trikloorietikkahappoa, 0,2 M natriumasetaattia ja 0,3 M etikkahappoa (punnitaan peräkkäin 1,64 g trikloorietikkahappoa + 1,64 g natriumasetaattia + 1,724 ml etikkahappoa, lisää 50 ml deionisoitua vettä, laimenna pH 4,0 HCl:ksi 100 ml).
Reagenssi III:
0,4 m natriumkarbonaattiliuosta (punnitaan 4,24 g vedetöntä natriumkarbonaattia ja liuotetaan 100 ml:aan vettä)
Reagenssi IV:
Foliinifenolireagenssi: laimenna 5 kertaa deionisoidulla vedellä.
Reagenssi V:
Entsyymilaimennusaine: 0,1 M natriumfosfaattiliuos, pH 8,0.
Reagenssi VI:
L-tyrosiinin standardiliuos: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tyrosiini liuotettuna 0,2 M HCl:ään.
Menettely
1. Kytke UV-Vis-spektrofotometri päälle ja valitse fotometrinen mittaus.
2. Aseta aallonpituudeksi 660 nm.
3. Kytke vesihaude päälle, säädä lämpötila 37℃, varmista, että lämpötila pysyy muuttumattomana 3-5 minuutin ajan.
4. Esilämmitä 0,5 ml substraattia 2 ml:n sentrifugiputkessa 37 ℃:n vesihauteessa 10 minuutin ajan.
5. Uuta 0,5 ml laimennettua entsyymiliuosta esilämmitettyyn sentrifugiputkeen 10 minuutin ajan.Aseta entsyymilaimennusaine tyhjäksi ryhmäksi.
6. Lisää 1,0 ml TCA-reagenssia välittömästi reaktion jälkeen.Sekoita hyvin ja inkuboi vesihauteessa 30 minuuttia.
7. Sentrifugoi reaktioliuos.
8. Lisää seuraavat komponentit määritetyssä järjestyksessä.
| Reagenssi | Äänenvoimakkuus |
| Supernatantti | 0,5 ml |
| 0,4 M natriumkarbonaatti | 2,5 ml |
| Foliinifenolireagenssi | 0,5 ml |
9. Sekoita hyvin ennen inkubointia vesihauteessa 37 ℃ 30 minuuttia.
10. OD660määritettiin OD:ksi1;nollakoekontrolliryhmä: Entsyymilaimennusainetta käytetään korvaamaan entsyymiliuos OD:n määrittämiseksi660kuten OD2, ΔOD = OD1-OD2.
11. L-tyrosiinin standardikäyrä: 0,5 ml eri konsentraatio L-tyrosiiniliuosta, 2,5 ml 0,4 M natriumkarbonaattia, 0,5 ml foliinifenolireagenssia 5 ml:n sentrifugiputkessa, inkuboi 37 ℃:ssa 30 minuuttia, havaitse OD660L-tyrosiinin eri konsentraatioille saatiin sitten standardikäyrä Y=kX+b, jossa Y on L-tyrosiinipitoisuus, X on OD600.
Laskeminen
2: Reaktioliuoksen kokonaistilavuus (ml)
0,5: Entsyymiliuoksen tilavuus (ml)
0,5: Kromogeenisessa määrityksessä käytetty reaktionesteen tilavuus (ml)
10: Reaktioaika (min)
Df: Laimennuskerroin
C: Entsyymipitoisuus (mg/ml)
Kuvat
Kuvio 1 DNA-tähde
| Näyte | Ave C4 | Nukleiinihappo Palautuminen (pg/mg) | Elpyminen(%) | Total Nucleic Happo ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83 % | 2,687 |
| PRK+STD2 | 18,723 | 126,728 | — | — |
| STD1 | 12,955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26,625 | |||
| RNA-vapaa H2O | Määrittämätön | — | — | — |
Kuva 2 Optimaalinen pH
Kuva 3 Optimaalinen lämpötila
Kuva 4 pH-stabiilisuus
Kuva 5 Lämpöstabiilisuus
Kuva 6 Varastointikestävyys 25 ℃:ssa
