EndoFree Plasmid Maxi Kit
Tämä pakkaus soveltuu uuttamiseen 150–300 ml:sta bakteeriliuosta, jota on viljelty yön yli käyttämällä parannettua SDS-emäksistä lyysimenetelmää bakteerien hajottamiseksi.Raakauute yhdistetään selektiivisesti ainutlaatuiseen Endotoxin Scavengeriin ja erotetaan sentrifugoimalla endotoksiinien poistamiseksi.Sitten silikageelikalvo sitoutuu selektiivisesti plasmidi-DNA:han liuoksessa olosuhteissa, joissa on paljon suolaa ja matala pH.Tämän jälkeen lisätään pesupuskuria epäpuhtauksien ja muiden bakteerikomponenttien poistamiseksi.Lopuksi käytetään vähäsuolaista ja korkean pH:n eluointipuskuria puhtaan plasmidi-DNA:n eluoimiseen piimatriisikalvolta.Silikageelikalvossa käytetään erityistä adsorptiokalvoa, ja adsorptiomäärän ero kolonnin ja kolonnin välillä on hyvin pieni ja toistettavuus on hyvä.Fenolia, kloroformia ja muita myrkyllisiä reagensseja ei vaadita, eivätkä myöskään etanolisaostusvaiheet.Tätä sarjaa voidaan käyttää uuttamaan nopeasti 0,2-1,5 mg puhdasta korkean kopion plasmidi-DNA:ta, uuttonopeudella 80-90%.Sarja käyttää ainutlaatuista prosessikaavaa, joka poistaa endotoksiinin, endotoksiinipitoisuus on erittäin alhainen ja solujen transfektiovaikutus on erinomainen.Uutettua plasmidia voitaisiin käyttää suoraan entsyymidigestiossa, PCR:ssä, in vitro -transkriptiossa, transformaatiossa, sekvensoinnissa ja muissa molekyylibiologisissa kokeissa.
Varastointiolosuhteet
RNaseA tulee säilyttää -30 ~ -15 ℃:ssa ja kuljettaa ≤0 ℃:ssa.
Endotoxin Scavenger voidaan säilyttää 2 ~ 8 ℃ lämpötilassa kuukauden ajan, -30 ~ -15 ℃ pitkäaikaista varastointia varten.ja kuljetetaan ≤0 ℃ lämpötilassa.
Muut komponentit tulee säilyttää huoneenlämmössä (15 ~ 25 ℃) ja kuljettaa huoneenlämmössä.
Komponentit
| Komponentit | 10RXNS |
| RNaasi A | 750 μl |
| Puskuri P1 | 75 ml |
| Puskuri P2 | 75 ml |
| Puskuri P4 | 75 ml |
| Endotoksiinien poistaja | 25 ml |
| Puskuri PW | 2 × 22 ml |
| Puskuri TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi -kolonnit (kukin 50 ml:n keräysputkessa) | 10 |
| Endotoksiiniton keräysputki | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, käytetään RNA:n poistamiseen.
Puskuri P1:bakteerisuspensiopuskuria, lisää RNaseA puskuriin P1 ennen ensimmäistä käyttöä.
Puskuri P2:bakteerien hajoamispuskuri (sisältää SDS/NaOH).
Puskuri P4:neutraloiva puskuri.
Endotoksiinien poistaja:poistaa tehokkaasti endotoksiinin raakaplasmidiuutteesta.
Puskuri PW:pesupuskuria, lisää määrätty määrä etanolia ennen ensimmäistä käyttöä.
Puskuri TB:eluointipuskuri.
FastPure DNA Maxi -kolonnit:plasmidi-DNA:n adsorptiopylväät.
Keräysputket 50 ml:suodoksen keräysputket.
Endotoksiiniton keräysputki:plasmidi-DNA:n keräysputket.
Valmistetut materiaalit
Absoluuttinen etanoli, isopropanoli, 50 ml pyöreäpohjaiset sentrifugiputket ja 50 ml endotoksiinivapaasentrifugiputket.
Sovellukset
Tämä tuote soveltuu laajamittaiseen plasmidien uuttamiseen 150-300 ml:sta bakteeriliuostaviljelty yön yli.
Kokeiluprosessi
1. Ota 150–200 ml (enintään 300 ml) yön yli viljeltyä bakteeriliuosta ja sentrifugoinoin 11 000 rpm (12 000 × g) 1 - 2 minuutin ajan.Hävitä supernatantti ja kerää bakteerit talteen.
Δ Kun kerätään yli 50 ml bakteeriliuosta, bakteerit voidaan kerätä lisäämällä bakteeriliuosta, sentrifugoimalla, hylkäämällä supernatantti ja muut vaiheet samassa 50 ml:n putkessa.
useita kertoja.
2. Lisää sentrifugiin 7,5 ml puskuria P1 (tarkista, onko RNaseA lisätty puskuriin P1)bakteereja sisältävään putkeen ja sekoita huolellisesti vorteksilla tai pipetoimalla.
Δ Bakteerien täydellinen uudelleensuspensointi tässä vaiheessa on kriittistä tuoton saamiseksi, eikä uudelleensuspendoinnin jälkeen pitäisi olla bakteeripaakkuja.Jos on bakteeripaakkuja, joita ei ole sekoittunut perusteellisesti, se vaikuttaa hajoamiseen, mikä johtaa alhaiseen saantoon ja puhtauteen.Jos bakteeriliuoksen OD600 on 0,65, on suositeltavaa käyttää 7,5 ml puskuria P1, kun uuttaminen 150 ml:sta bakteeriliuosta;kun OD600 on 0,75, tulee käyttää 8 ml puskuria P1 ja puskurien P2 ja P4 tilavuuksia tulee muuttaa vastaavasti.Jos bakteeriliuoksen tilavuus suurennetaan 200 ml:aan, on suositeltavaa, ettäpuskurien P1, P2 ja P4 tilavuutta lisätään vastaavasti.
3. Lisää 7,5 ml puskuria P2 bakteerisuspensioon vaiheesta 2 ja sekoita varovasti ylös ja alas 6–8kertaa ja inkuboi huoneenlämmössä 4-5 minuuttia.
Δ Käännä varovasti ylösalaisin sekoittaaksesi perusteellisesti.Vorteksointi aiheuttaa genomisen DNA:n fragmentoitumisen, mikä johtaa genomisen DNA-fragmenttien muodostumiseen uutetussa plasmidissa.Tällä hetkellä liuoksesta tulee viskoosi ja läpikuultava, mikä osoittaa, että bakteerit ovat täysin hajotettuja.Kesto ei saisi ylittää 5 minuuttia plasmidien tuhoutumisen välttämiseksi.Jos liuos ei ole kirkas, seurauksena saattaa olla liian monta bakteeriaepätäydellinen hajoaminen, joten bakteerien määrää tulee vähentää asianmukaisesti.
4. Lisää 7,5 ml puskuria P4 bakteerisuspensioon vaiheesta 3 ja käännä välittömästi varovasti ylösalaisin 6–8 kertaa, jotta liuos neutraloi puskuri P2 kokonaan.Tässä vaiheessa pitäisi ilmestyä valkoista flokkuloivaa sakkaa.Sentrifugoi yli noin 11 000 rpm (12 000 × g) 10–15 minuutin ajan, pipetoi supernatantti varovasti uuteen 50 ml:n pyöreäpohjaiseen sentrifugiputkeen (itse valmistettu) ja vältäime kelluva valkoinen sakka.
Δ Lisää puskuri P4 ja käännä välittömästi ylösalaisin, jotta se sekoittuu hyvin.Anna putken seistä, kunnes valkoinen sakka on jakautunut tasaisesti kaikkialle liuokseen, jotta estetään paikallisen saostumisen muodostuminen, joka voi vaikuttaa neutraloitumiseen.Jos ennen sentrifugointia ei esiinny tasaista valkoista flokkuloivaa sakkaa ja supernatantti ei ole kirkas sentrifugoinnin jälkeen, putki voidaansentrifugoidaan vielä 5 minuuttia.
5. Lisää 0,1 kertaa tilavuus (10 % supernatantin tilavuudesta, noin 2,2 ml) Endotoxin Scavenger -liuosta vaiheen 4 supernatanttiin ja käännä kääntelemällä sekoittaaksesi.Aseta liuos jäähauteeseen tai laita jäämurskaan (tai jääkaapin pakastimeen) 5 minuutiksi, kunnes liuos muuttuu sameasta kirkkaaksi ja läpinäkyväksi (tai edelleenhieman samea) ja sekoita ajoittain useita kertoja.
Δ Kun endotoksiininpoistoaine on lisätty supernatanttiin, supernatantti muuttuu sameaksi, muttasupernatantin tulee muuttua kirkkaaksi (tai hieman sameaksi) jäähauteessa jäähdyttämisen jälkeen.
6. Kun supernatantti on asetettu huoneenlämpöön (>25 ℃) 10–15 minuutiksi, se muuttuu sameaksisen lämpötila nousee huoneenlämpötilaan.Sitten supernatantti tulee kääntää ylösalaisin sekoittumaan.
Δ Jos huoneen lämpötila on alhaisempi tai haluat lyhentää uuttoaikaa, supernatanttia voidaan inkuboida 37 ~ 42 ℃ vesihauteessa 5 - 10 minuuttia ja seuraava vaihe voidaan suorittaa supernatantin jälkeen.muuttuu sameaksi.
7. Sentrifugoi supernatanttia noin 11 000 rpm (12 000 × g) 10 minuuttia huoneenlämpötilassa (lämpötilan on oltava > 25 ℃) faasin erottamiseksi.Ylempi vesifaasi sisältää DNA:n, kun taas alempi sininen öljyfaasikerros sisältää endotoksiinia ja muita epäpuhtauksia.SiirräDNA:ta sisältävä vesifaasi uuteen putkeen jahävitä öljyinen kerros.
Δ Sentrifugoinnin aikana lämpötilan on oltava yli 25 ℃, koska tehokas faasien erotus ei oletapahtuu, jos lämpötila on liian alhainen.
Δ Jos faasien erotus ei ole tehokas, sentrifugointilämpötila voidaan säätää 30 ℃:seen jasentrifugointiaikaa voidaan pidentää 15 minuuttiin.
Δ Älä ime sinistä öljyistä kerrosta, sillä se sisältää endotoksiinia ja muita epäpuhtauksia.
Mekanismi
Resuspendoi lyysin neutralointi
◇ Lisää 7,5 ml puskuria P1
◇ Lisää 7,5 ml puskuria P2
◇ Lisää 7,5 ml puskuria P4
Endotoksiinien poisto
◇ Lisää 0. 1 kertaa Endotoxin Scavengerin supernatanttitilavuus
Sidonta ja pesu
◇ Lisää 0,5 kertaa isopropanolin tilavuus
◇ Lisää 10 ml PW-puskuria
◇ Lisää 10 ml PW-puskuria
Eluointi
◇ Lisää 1–2 ml TB-puskuria tai endotoksiinitonta ddH2O:ta
