M-MLV Neoscript -käänteistranskriptaasi
Neoscript Reverse Transcriptase on käänteiskopioija, joka on saatu Moloney-hiiren leukemiaviruksen alkuperän M-MLV-geenin mutaatioseulonnalla ja ekspressiolla E. colissa.Entsyymi poistaa RNaasi H -aktiivisuuden, sietää korkeampaa lämpötilaa ja soveltuu korkean lämpötilan käänteistranskriptioon.Siksi se on hyödyllinen eliminoitaessa RNA:n korkean tason rakenteen ja epäspesifisten tekijöiden epäsuotuisat vaikutukset cDNA-synteesiin, ja sillä on korkeampi stabiilisuus ja käänteistranskription synteesikyky.Entsyymillä on korkeampi stabiilisuus ja käänteistranskription synteesikyky.
Komponentit
1.200 U/μL Neoscript-käänteistranskriptaasi
2.5 × ensimmäisen säikeen puskuri (valinnainen)
* 5 × First-Strand -puskuri ei sisällä dNTP:tä, lisää dNTP:t kun valmistellaan reaktiojärjestelmää
Suositeltu sovellus
1.Yksivaiheinen qRT-PCR.
2.RNA-viruksen havaitseminen.
Säilytysolosuhteet
-20°C pitkäaikaista varastointia varten, sekoita hyvin ennen käyttöä, vältä toistuvaa jäätymistä ja sulattamista.
Yksikön määritelmä
Yksi yksikkö sisältää 1 nmol dTTP:tä 10 minuutissa 37 °C:ssa käyttämällä poly(A)•oligo(dT)25mallina/pohjamaalina.
Laadunvalvonta
1.SDS-PAGE-elektroforeettinen puhtaus yli 98 %.
2.Vahvistusherkkyys, erä-eräohjaus, vakaus.
3.Ei eksogeenistä nukleaasiaktiivisuutta, ei eksogeenistä endonukleaasi- tai eksonukleaasikontaminaatiota
Ensimmäisen ketjureaktioratkaisun reaktioasetukset
1.Reaktioseoksen valmistus
| Komponentit | Äänenvoimakkuus |
| Oligo(dT)12-18 Primer tai Random Primera Tai geenispesifisiä alukkeitab | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μl |
| Templaatti-RNA | Kokonais-RNA ≤ 5 µg;mRNA ≤ 1 µg |
| RNaasi-vapaa dH2O | 10 μl asti |
Huomautuksia:a/b: Valitse erityyppiset pohjamaalit kokeellisten tarpeidesi mukaan.
2.Kuumenna 65 °C:ssa 5 minuuttia ja jäähdytä nopeasti jäillä 2 minuuttia.
3.Lisää seuraavat komponentit yllä olevaan järjestelmään 20 µl:n kokonaistilavuuteen ja sekoita varovasti:
| Komponentit | Äänenvoimakkuus (μL) |
| 5 × ensimmäisen säikeen puskuri | 4 |
| Neoscript-käänteistranskriptaasi (200 U/μl) | 1 |
| RNaasi-inhibiittori (40 U/μl) | 1 |
| RNaasi-vapaa dH2O | 20 μl asti |
4. Suorita reaktio seuraavien ehtojen mukaisesti:
(1) Jos käytetään Random Primeria, reaktio tulisi suorittaa 25 ℃:ssa 10 minuutin ajan ja sitten 50 ℃:ssa 30 - 60 minuutin ajan;
(2) Jos käytetään Oligo dT:tä tai erityisiä alukkeita, reaktio tulisi suorittaa 50 ℃:ssa 30-60 minuutin ajan.
5.Kuumenna 95 ℃:ssa 5 minuuttia Neoscriptin käänteistranskriptaasin inaktivoimiseksi ja reaktion lopettamiseksi.
6.Käänteistranskriptiotuotteita voidaan käyttää suoraan PCR-reaktiossa ja kvantitatiivisessa fluoresenssi-PCR-reaktiossa tai niitä voidaan säilyttää -20 ℃:ssa pitkään.
PCR Rtoiminta:
1.Reaktioseoksen valmistus
| Komponentit | Keskittyminen |
| 10 × PCR-puskuri (ei sisällä dNTP:tä, ei sisällä Mg²+:ta) | 1× |
| dNTP:t (10 mM kukin dNTP) | 200 µM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA -polymeraasi (5U/μl) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 µM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 µM |
| Sapluunaa | ≤10 % ensimmäisen ketjureaktion liuos (2 μL) |
| ddH2O | 50 μl asti |
Huomautuksia:a: Jos lisätään liikaa ensimmäisen ketjun reaktioliuosta, PCR-reaktio saattaa estyä.
2.PCR-reaktiomenettely
| Vaihe | Lämpötila | Aika | Pyörät |
| Esidenaturointi | 95℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturaatio | 95℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Hehkutus | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Laajennus | 72℃ | 10-60 sek |
Huomautuksia
1.Soveltuu käänteisen transkription lämpötilan optimointiin alueella 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Sillä on parempi stabiilisuus, se sopii korkean lämpötilan käänteisen transkription vahvistukseen.Lisäksi se on edullinen läpäisemään tehokkaasti RNA:n monimutkaisia rakennealueita.Myös sesopii yksivaiheiseen multipleksifluoresenssikvantitatiiviseen RT-PCR-detektioon.
3.Hyvä yhteensopivuus erilaisten PCR-amplifikaatioentsyymien kanssa ja soveltuu erittäin herkkiin RT-PCR-reaktioihin.
4.Soveltuu erittäin herkkään yksivaiheiseen fluoresenssikvantitatiiviseen RT-PCR-reaktioon, parantaa tehokkaasti templaattien alhaisen pitoisuuden havaitsemisnopeutta.
5.Soveltuu cDNA-kirjaston rakentamiseen.
