DNA Extraction Mini Kit
Tämä pakkaus käyttää optimoitua puskurijärjestelmää ja silikageelipylväspuhdistustekniikkaa, joka voi ottaa talteen 70 bp – 20 kb DNA-fragmentteja eri pitoisuuksista TAE- tai TBE-agaroosigeeliä.DNA-adsorptiokolonni voi erityisesti adsorboida DNA:ta runsaasti suolaa sisältävissä olosuhteissa.Lisäksi pakkaus voi suoraan puhdistaa DNA-fragmentteja PCR-tuotteista, entsymaattisista reaktiojärjestelmistä tai muilla menetelmillä saaduista raaka-DNA-tuotteista ja poistaa epäpuhtauksia, kuten proteiineja, muita orgaanisia yhdisteitä, epäorgaanisia suola-ioneja ja oligonukleotidialukkeita.Se voi varmistaa, että puhdistus voidaan suorittaa 10-15 minuutissa.Puhdistettua DNA:ta voidaan käyttää suoraan ligaatioon, transformaatioon, entsyymidigestioon, in vitro -transkriptioon, PCR:ään, sekvensointiin, mikroinjektioon jne.
Varastointiolosuhteet
Säilytä -15 ~ -25 ℃ ja kuljeta huoneenlämmössä.
Komponentit
| Komponentit | (100 rxns) |
| Puskurin BKT | 80 ml |
| Puskuri GW | 2 × 20 ml |
| Eluointipuskuri | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Puskurin BKT:DNA:ta sitova puskuri.
Puskuri GW:Pesupuskuri;lisää absoluuttista etanolia pulloon ilmoitetun tilavuuden verran ennen käyttöä.
Eluointipuskuri:Eluointi.
FastPure DNA Mini Columns-G:DNA-adsorptiokolonnit.
Keräysputket 2 ml:Keräysputket suodosta varten.
Valmistetut materiaalit
1,5 ml steriloituja putkia, absoluuttista etanolia ja isopropanolia (kun DNA-fragmentti ≤100 bp, lisää 1 tilavuus
isopropanoli 1 tilavuuteen geeliä), vesihaude.
Kokeiluprosessi
Lisää 80 ml etanolia puskurin GW laimentamiseksi etiketin mukaisesti ennen käyttöä, säilytä huoneenlämmössä.
Mekanismi
1. PCR-reaktioliuos
Geelin uuttokaavio: Lisää yhtä suuri määrä puskuri GDP PCR -reaktioliuoksen talteenottokaavio:Lisää 5-kertainen tilavuuspuskuri
2. BKT Laske geelin tilavuus (100 μl vastaa 100 mg)
Liuota geeli
3. Esilämmitä 50-55 asteeseen℃
4. Sidospesu
Lisää 300 μl bruttokansantuotepuskuria*
Lisää 700 µl puskuria GW
Lisää 700 µl puskuria GW
5. Elute
Lisää 20–30 µl eluointipuskuria tai deionisoitua vettä
Huomautuksia* PCR-reaktionesteen talteenotto ilman tätä vaihetta
Geelinpoistoohjelma
1. DNA-fragmenttien fraktiointia varten suoritetun DNA-elektroforeesin jälkeen leikkaa yksittäinen DNA-fragmentin raita agaroosigeelistä UV-valossa.On suositeltavaa käyttää imukykyistä paperia geelin näennäisen kosteuden imemiseksi ja geeliviipaleen koon minimoimiseksi poistamalla ylimääräinen agaroosi mahdollisimman paljon.Punnitse geeliviipale (ilman mikrosentrifugiputkea) sen tilavuuden laskemiseksi: 100 mg:n geeliviipaleen tilavuus on noin 100 µl, jos tiheys on 1 g/ml.
2. Lisää yhtä suuri määrä GDP-puskuria, inkuboi 50-55 ℃:ssa 7-10 minuuttia (säädä inkubointiaikaa geelin koon mukaan, kunnes geeli on täysin liuennut).Käännä putki ylösalaisin 2 kertaa inkubaation aikana.
Δ Puskurin GDP:n 1-3 tilavuuden lisääminen ei vaikuta DNA:n talteenoton tehokkuuteen.Jos talteenotettava DNA-fragmentti <100 bp, on lisättävä 3 tilavuutta GDP-puskuria;Kun geeliviipale on liuennut kokonaan, lisää 1 tilavuus isopropanolia ja sekoita huolellisesti ja jatka sitten seuraavaan vaiheeseen.
3. Sentrifugoi lyhyesti saadaksesi näyte putken pohjalle, aseta FastPure DNA Mini Columns-G 2 ml:n keräysputkiin, siirrä liuosta varovasti enintään 700 µl kerran vuorokaudessa.
aikaa suodatuskolonniin, sentrifugoi nopeudella 12 000 rpm (13 800 x g) 30-60 sekuntia.
4. Hävitä suodos ja lisää 300 µl GDP-puskuria pylvääseen, inkuboi huoneenlämmössä 1 minuutin ajan, sentrifugoi nopeudella 12 000 rpm (13 800 X g) 30-60 sekuntia.
5. Hävitä suodos ja lisää 700 µl puskuria GW (tarkista, onko absoluuttista etanolia lisätty etukäteen!) pylvääseen, sentrifugoi 12 000 rpm (13 800 X g) 30-60 sekuntia.
Δ Lisää puskuri GW adsorptiokolonnin seinämän ympärille tai lisää Buffer GW takakansi ja sekoita sitä ylösalaisin 2–3 kertaa, jotta putken seinämään tarttuva suola huuhdellaan kokonaan.
6. Toista vaihe 5.
Δ Huuhtelu puskurilla GW kahdesti voi varmistaa, että suola poistetaan kokonaan ja poistaa vaikutuksen myöhemmissä kokeissa.
7. Hävitä suodos ja sentrifugoi tyhjää kolonnia nopeudella 12 000 rpm (13 800 X g) 2 minuuttia.
8. Aseta kolonni puhtaaseen 1,5 ml:n mikrosentrifugiputkeen, lisää 20 - 30 µl eluointipuskuria kolonnin kalvon keskelle, inkuboi 2 minuuttia ja sentrifugoi sitten 12 000 rpm (13 800 X g) 1 minuutin ajan.Hävitä pylväs, säilytä saatu DNA -20 °C:ssa.
A Vaiheen 8 supernatantin siirtäminen pylvääseen eluoitumaan uudelleen ja eluointipuskurin esikuumennus 55 °C:seen (kun DNA-fragmentti >3 kb) saattaa auttaa lisäämään talteenottotehokkuutta.
PCR-tuotteiden palautusohjelma
Tätä protokollaa voidaan soveltaa DNA-fragmenttien puhdistamiseen PCR-tuotteista, entsymaattisista reaktiojärjestelmistä ja muista DNA:n raakatuotteista (mukaan lukien geneettinen DNA).Tämä liuos voi tehokkaasti poistaa erilaisia nukleotideja, alukkeita, alukedimeerejä, suolamolekyylejä, entsyymejä ja muita epäpuhtauksia.
1. Sentrifugoi lyhyesti PCR-tuotteet, entsymaattinen reaktioliuos ja muut DNA:n raakatuotteet.Arvioi niiden tilavuus pipetillä ja siirrä steriloituun 1,5 ml:n tai 2 ml:n putkeen.Lisää ddH2O:ta, kunnes tilavuus on 100 µl;kun taas genomisen DNA:n, jolla on korkea pitoisuus, laimentaminen 300 µl:aan ddH2O:lla auttaa parantamaan talteenottotehokkuutta.
2. Lisää 5 tilavuutta puskuri GDP:tä, sekoita huolellisesti kääntämällä tai vorteksoimalla.Jos mielenkiinnon kohteena oleva DNA-fragmentti > 100 bp, on lisättävä 1,5 tilavuutta (näytteet + puskuri GDP) etanolia.
3. Aseta kolonni takaisin keräysputkeen, siirrä seos kolonniin, sentrifugoi 12 000 rpm (13 800 × g) 30 - 60 sekuntia.Jos sekoitetun liuoksen tilavuus on > 700 µL, laita adsorptiokolonni takaisin keräysputkeen, siirrä jäljellä oleva liuos adsorptiokolonniin ja sentrifugoi nopeudella 12 000 rpm (13 800 × g) 30–60 sekuntia.
4. Seuraava suoritus viittaa 08-1/Gel-uuttoohjelman vaiheisiin 5–8.
Sovellukset
Eri pitoisuuksia TAE- tai TBE-agaroosigeeliä;PCR-tuotteet, entsymaattiset reaktiojärjestelmät tai muut eri menetelmillä saadut raaka-DNA-tuotteet.Palautetut fragmentit vaihtelivat70 bp - 20 kb.
Huomautuksia
Vain tutkimuskäyttöön.Ei käytettäväksi diagnostisissa toimenpiteissä.
1. Lisää 80 ml etanolia puskurin GW laimentamiseksi etiketin osoittamalla tavalla ennen käyttöä, säilytä huoneenlämmössä.
2. Jos GDP-puskuri on helppo saostaa matalassa lämpötilassa varastoinnin aikana, se voidaan asettaa huoneenlämpöön jonkin aikaa ennen käyttöä.Tarvittaessa sitä voidaan esilämmittää 37 ℃ vesihauteessa, kunnes sakka on täysin liuennut, ja sitten sitä voidaan käyttää sekoituksen jälkeen.
3. Aseta vesihauteen lämpötila 50 ~ 55 ℃ etukäteen.
4. 08-1/Gel-uuttoohjelman vaiheessa 1 geeliviipaleen koon minimoiminen vähentää merkittävästi liukenemisaikaa ja lisää talteenottotehokkuutta (linearisoitu DNA on helposti hydrolysoituva, kun se altistetaan jatkuvasti korkeassa lämpötilassa).Älä altista DNA-geeliä UV-säteilylle pitkäksi aikaa, koska ultraviolettivalo voi aiheuttaa DNA-vaurioita.
5. Liuota geeli kokonaan 08-1/Gel-uuttoohjelman vaiheessa 2, muuten DNA:n talteenottotehokkuus heikkenee vakavasti.
6. Esilämmitä eluointipuskuri tai ddH2O 55 ℃:seen, mikä auttaa parantamaan DNA-eluointitehokkuutta.On suositeltavaa säilyttää DNA 2,5 mM Tris-HCl-eluentissa, pH 7,0 – 8,5.
