2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Cat nro: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) on suunniteltu suorittamaan PCR suoraan näytteistä ilman DNA:n uuttamista tai näytteen valmistelua.Tämä reagenssi koostuu kuumakäynnistys-DNA-polymeraasista, urasiili-DNA-glykosylaasista (UNG), RNaasi-inhibiittorista, MgCl:sta2dNTP:t (dUTP:llä dTTP:n sijasta) ja stabilisaattorit kvantitatiiviseen PCR:ään (qPCR).Tämä reagenssi muodostaa korkean inhibiittoritoleranssin, ja siksi sitä voidaan käyttää suoraan näytteiden, kuten kurkkupuikon, syljen, antikoaguloituneen kokoveren, plasman ja seerumin havaitsemiseen ilman DNA-uuttoa.Reagenssi käyttää patentoitua puskuria qPCR:ään, jossa on sekoitettuja entsyymejä, anti-inhibitorista DNA-polymeraasia ja UNG-entsyymiä.Siksi se voi saada hyvän amplifikaation kohdegeenien näytteissä, jotka sisältävät inhibiittoreita, ja estää PCR-jäännös- ja aerosolisaasteen aiheuttaman väärän positiivisen monistumisen.Tämä reagenssi on yhteensopiva useimpien fluoresoivien kvantitatiivisten PCR-laitteiden kanssa, kuten Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche ja niin edelleen.
Komponentit
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG-sekoitus
2. 2 × SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Varastointiolosuhteet
Kaikki komponentit tulee säilyttää -20 ℃:ssa pitkäaikaista varastointia varten ja 4℃:ssa enintään 3 kuukauden ajan.Sekoita huolellisesti sulatuksen jälkeen ja sentrifugoi ennen käyttöä.Vältä toistuvaa jäätymistä ja sulattamista.
Pyöräilyprotokolla
| Vaihe | Lämpötila | Aika | Kierrä |
| Ruoansulatus | 50℃ | 2 min | 1 |
| Polymeraasin aktivointi | 95℃ | 1-5 min | 1 |
| Denaturointi | 95℃ | 10-20s | 40-50 |
| Hehkutus/pidennys | 56-64℃ | 20-60 luvulla |
Pipetointiohjeet
| Reagenssi | Tilavuus per reaktio | Tilavuus per reaktio | Lopullinen keskittyminen |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 µl | 25 µl | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 µl | 1 µl | 1× |
| 25 × Primer-Probe Mix1, 2 | 1 µl | 2 µl | 1× |
| Näyte3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Kokonaistilavuus | 25 μl | 50 µl | - |
1. Alukkeen lopullinen pitoisuus on yleensä 0,2 μM.Parempien tulosten saamiseksi alukkeen pitoisuus voidaan optimoida alueella 0,2-1 μM.
2. Yleensä koettimen pitoisuus voidaan optimoida välillä 0,1-0,3 μM.Koettimen optimaalinen pitoisuus liittyy reaaliaikaiseen PCR-amplifikaatiolaitteeseen, koettimen tyyppiin ja fluoresoivan leimausaineen tyyppiin.Katso laitteen käyttöohjeet tai kunkin fluoresoivan anturin erityisvaatimukset.
3. Erityyppiset näytteet sisältävät erityyppisiä ja -sisältöisiä inhibiittoreita ja kohdegeenin kopiomäärää.Näytteen tilavuus on otettava huomioon todellisen tilan mukaan.Laimenna näyte lisäämällä tarvittaessa nukleaasivapaata vettä tai TE-puskuria.
4. Eri näytteiden suositeltu määrä:
| Näyte | Tilavuus yhdelle 50 μL reaktio | Enimmäismäärä suhde |
| Antikoaguloitunut kokoveri | 2,5 μl | 5% |
| Plasma | 15 μl | 30 % |
| Seerumi | 10 μl | 20 % |
| Vanupuikko kurkusta | 10 μl | 20 % |
| Sylki | 10 μl | 20 % |
Laadunvalvonta
1. Toiminnan havaitseminen: qPCR:n herkkyys, spesifisyys ja toistettavuus.
2. Ei eksogeenistä nukleaasiaktiivisuutta: ei eksogeenistä endonukleaasi- ja eksonukleaasisaastetta.
Tuotteen huomautukset
1. Tämä tuote käyttää uudenlaista kuumakäynnistys-DNA-polymeraasia, joka voidaan aktivoida 1-5 minuutissa. Koska sen reaktiopuskuri on optimoitu, se soveltuu paremmin kaksois- tai monifluoresenssikvantitatiiviseen PCR:ään koetinmenetelmällä.
2. Jos PCR-monistuksen Rn-arvo on liian pieni tai monistus on selvästi estynyt, näytemäärän vähentäminen, reaktiotilavuuden lisääminen tai näytteen aikaisempi laimentaminen voivat parantaa tuloksia.
3. Veren, syljen, virtsan, nielupuikkojen jne. keräämisen tulee noudattaa kliinisiä kriteerejä, ja tuoretta näytettä voidaan käyttää estämään nukleiinihappojen hajoamista.
4. Koska eri amplikoneilla on erilainen käyttötehokkuus kuin dUTP:lla ja herkkyys UNG:lle, reagenssit tulee optimoida, jos havaitsemisherkkyys laskee UNG-järjestelmää käytettäessä.Ota tarvittaessa yhteyttä teknistä tukea varten.
5. Siirtyvien PCR-tuotteiden monistumisen välttämiseksi yksivaiheisten reaktioiden välillä tarvitaan erillinen koealue ja pipetti amplifikaatiota varten.Käytä käsineitä ja vaihda niitä usein äläkä avaa reaktioputkea PCR-monistuksen jälkeen.
