Warm Start Bst 2.0 DNA-polymeraasi (glyseroliton)
Bst-DNA-polymeraasi V2 on peräisin Bacillus stearothermophilus DNA Polymerase I:stä, jolla on 5'→3'-DNA-polymeraasiaktiivisuutta ja vahva ketjunkorvausaktiivisuus, mutta ei 5'→3'-eksonukleaasiaktiivisuutta.Bst DNA Polymerase V2 soveltuu ihanteellisesti juosteen syrjäyttämiseen, isotermiseen amplifikaatioon LAMP (silmukkavälitteiseen isotermiseen amplifikaatioon) ja nopeaan sekvensointiin.Bst DNA-polymeraasi V2 on kuumakäynnistysversio, joka perustuu Bst DNA-polymeraasi V2:een (HC5005A), joka on saatu reversiibelillä modifikaatiotekniikalla ja joka voi estää DNA-polymeraasin aktiivisuuden huoneenlämpötilassa, joten reaktiojärjestelmää voidaan käyttää ja formuloida huoneenlämpötilassa, jotta estetään -spesifinen vahvistus ja parantaa reaktion tehokkuutta, ja tämä versio voidaan lyofilisoida.Lisäksi sen aktiivisuus vapautuu korkeissa lämpötiloissa, joten erillistä aktivointivaihetta ei tarvita.
Komponentit
| Komponentti | HC5006A-01 | HC5006A-02 | HC5006A-03 |
Bst DNA -polymeraasi V2 (glyseroliton) (8 U/μl) | 0,2 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HC Bst V2 -puskuri | 1,5 ml | 2 x 1,5 ml | 3 × 10 ml |
| MgSO4(100mM) | 1,5 ml | 2 x 1,5 ml | 2 × 10 ml |
Sovellukset
1.LAMP-isoterminen vahvistus
2.DNA-juosteen yhden syrjäytysreaktio
3.Korkea GC-geenisekvensointi
4.DNA-sekvensointi nanogrammatasolla.
Säilytysolosuhteet
Kuljetus alle 0°C ja säilytettävä -25°C ~ -15°C.
Yksikön määritelmä
Yksi yksikkö määritellään entsyymimääräksi, joka liittää 25 nmol dNTP:tä happoon liukenemattomaan materiaaliin 30 minuutissa 65 °C:ssa.
Laadunvalvonta
1.Proteiinin puhtausmääritys (SDS-PAGE):Bst DNA-polymeraasi V2:n puhtaus on >99 % määritettynä SDS-PAGE-analyysillä käyttäen Coomassie Blue -detektiota.
2.EndonukleaasiToiminta:50 µl:n reaktiota, joka sisältää vähintään 8 U Bst DNA-polymeraasi V2:ta ja 1 µg λDNA:ta, inkubointi 16 tunnin ajan 37 ℃:ssa ei aiheuta havaittavaa hajoamista määritettynä.
3.Eksonukleaasiaktiivisuus:Vähintään 8 U Bst DNA-polymeraasi V2:ta sisältävän 50 µl:n reaktion inkubointi 1 µg λ-Hind Ⅲ -digesti-DNA:n kanssa 16 tunnin ajan 37 ℃:ssa ei aiheuta havaittavaa hajoamista määritettynä.
4.Nickase-toiminta:Vähintään 8 U Bst DNA-polymeraasi V2:ta sisältävän 50 µl:n reaktion inkubointi 1 µg:n pBR322 DNA:n kanssa 16 tunnin ajan 37 °C:ssa ei aiheuta havaittavaa hajoamista määritettynä.
5.RNase-aktiivisuus:50 µl:n reaktiota, joka sisältää vähintään 8 U Bst DNA-polymeraasi V2:ta ja 1,6 µg MS2 RNA:ta, inkubointi 16 tunnin ajan 37 °C:ssa ei aiheuta havaittavaa hajoamista määritettynä.
6.E. coliDNA:120 U Bst DNA -polymeraasi V2:ta seulotaan E. colin genomisen DNA:n esiintymisen suhteen käyttämällä TaqMan qPCR:ää E. coli 16S rRNA-lokukselle spesifisten alukkeiden kanssa.E. colin genominen DNA:n kontaminaatio on ≤1 kopio.
LAMPPU Reaktio
| Komponentit | 25μL |
| 10 × HC Bst V2 -puskuri | 2,5 μl |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 μl |
| dNTP:t (kukin 10mM) | 3,5 μl |
| SYTO™ 16 Green (25×)a | 1,0 μl |
| Primer sekoitusb | 6 μl |
| Bst DNA Polymerase V2 (glyseroliton) (8 U/uL) | 1 μl |
| Sapluuna | × μL |
| ddH2O | Jopa 25 μl |
Huomautuksia:
1) a.SYTOTM 16 Green (25×): Kokeellisten tarpeiden mukaan muita väriaineita voidaan käyttää korvikkeena;
2) b.Pohjukaseos: saatu sekoittamalla 20 µM FIP, 20 µM BIP, 2,5 µM F3, 2,5 µM B3, 5 µM LF, 5 µM LB ja muita tilavuuksia.
Reaktio ja kunto
1 × HC Bst V2 -puskuri, inkubointilämpötila on 60 °C - 65 °C.
Lämmön poisto
80 °C, 20 minuuttia
