Vaccinia-viruksen rajoitusentsyymi

Vaccinia-virusta rajoittava entsyymi on peräisin rekombinantista E. coli -kannasta, joka kantaa Vaccinia capping -entsyymin geenejä.Tämä yksittäinen entsyymi koostuu kahdesta alayksiköstä (D1 ja D12) ja sillä on kolme entsymaattista aktiivisuutta (RNA-trifosfataasi ja guanyylitransferaasi D1-alayksikössä ja guaniinimetyylitransferaasi D12-alayksikössä).Vaccinia-viruksen katkaisuentsyymi katalysoi tehokkaasti cap-rakenteen muodostumista, joka voi kiinnittää spesifisesti 7-metyyliguanylaattihatun rakenteen (m7Gppp, Cap 0) RNA:n 5'-päähän.Cap-rakenteella (Cap 0) on tärkeä rooli mRNA:n stabiloinnissa, kuljetuksessa ja translaatiossa eukaryooteissa.RNA:n sulkeminen entsymaattisella reaktiolla on tehokas ja yksinkertainen menetelmä, joka voi parantaa merkittävästi RNA:n stabiilisuutta ja translaatiota in vitro -transkriptiota, transfektiota ja mikroinjektiota varten.

Komponentit

Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μl)

10 × rajoituspuskuri

Varastointiolosuhteet

-25～- 15 ℃ varastointia varten (Vältä toistuvia pakastus-sulatusjaksoja)

Tallennuspuskuri

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glyserolia.

Yksikön määritelmä

Yksi yksikkö Vaccinia-viruksen peittoentsyymiä määritellään entsyymimääräksi, joka tarvitaan sisällyttämään 10 pmol GTP:tä 80 nt:n transkriptiin 1 tunnissa 37 °C:ssa.

Laadunvalvonta

Eksonukleaasi:10 U Vaccinia-viruksen peittoentsyymiä, jossa on 1 μg λ-Hind III -digesti-DNA:ta 37 ℃:ssa 16 tunnin ajan, ei aiheuta hajoamista agaroosigeelielektroforeesilla määritettynä.

Endonukleaasi:10 U Vaccinia-viruksen peittoentsyymiä, jossa on 1 μg λDNA:ta 37 °C:ssa 16 tunnin ajan, ei tuota hajoamista agaroosigeelielektroforeesilla määritettynä.

Nickase:10 U Vaccinia-viruksen peittoentsyymiä, jossa on 1 μg pBR322:ta 37 ℃:ssa 16 tunnin ajan, ei tuota hajoamista agaroosigeelielektroforeesilla määritettynä.

RNaasi:10 U Vaccinia-viruksen peittoentsyymiä, jossa on 1,6 μg MS2 RNA:ta 4 tunnin ajan 37 °C:ssa, ei tuota hajoamista agaroosigeelielektroforeesilla määritettynä.

1.colin DNA:10 U Vaccinia virus Cappping Enzymeä seulotaan E. colin genomisen DNA:n läsnäolon suhteen käyttämällä TaqMan qPCR:ää E. coli 16S rRNA-lokukselle spesifisten alukkeiden kanssa.E. colin genominen DNA:n kontaminaatio on ≤1 E. colin genomi.

2.Bakteeri Endotoksiini: LAL-testi, Kiinan farmakopean IV 2020 painoksen mukaan, geelirajatestimenetelmä, yleissääntö (1143).Bakteerien endotoksiinipitoisuuden tulee olla ≤10 EU/mg.

Reaktiojärjestelmä ja olosuhteet

1. Cappping Protocol (reaktiotilavuus: 20 μL)

Tämä menettely soveltuu 10 μg RNA:n (≥100 nt) sulkemisreaktioon ja sitä voidaan skaalata kokeellisten vaatimusten mukaan.

I) Yhdistä 10 μg RNA:ta ja nukleaasivapaata H2O:ta 1,5 ml:n mikrofugiputkessa lopulliseen tilavuuteen 15,0 µL.*10 × päällystyspuskuri: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Kuumenna 65 ℃:ssa 5 minuuttia ja sen jälkeen jäähauteessa 5 minuutin ajan.

3) Lisää seuraavat komponentit määritetyssä järjestyksessä

*10 × päällystyspuskuri: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Inkuboidaan 37 °C:ssa 30 minuuttia, RNA on nyt suljettu ja valmis myöhempään käyttöön.

2. 5′ liitin leimausreaktio (reaktiotilavuus: 20 μL)

Tämä protokolla on suunniteltu merkitsemään RNA:ta, joka sisältää 5' trifosfaattia, ja sitä voidaan skaalata tarpeiden mukaan.Leiman sisällyttämisen tehokkuuteen vaikuttaa RNA:n:GTP:n moolisuhde sekä GTP-pitoisuus RNA-näytteissä.

1) Yhdistä sopiva määrä RNA:ta ja nukleaasivapaata H2O:ta 1,5 ml:n mikrofugiputkessa lopulliseen tilavuuteen 14,0 µl.

2) Kuumenna 65 ℃:ssa 5 minuuttia ja sen jälkeen jäähauteessa 5 minuutin ajan.

3)Lisää seuraavat komponentit määritetyssä järjestyksessä.

** GTP MIX tarkoittaa GTP:tä ja pientä määrää markkereita.Katso GTP:n pitoisuushuomautukseen 3.

4) Inkuboi 37 °C:ssa 30 minuuttia, RNA:n 5'-pää on nyt leimattu ja valmis alavirtaan

Sovellukset

1. mRNA:n sulkeminen ennen translaatiomäärityksiä/in vitro -translaatiota

2. mRNA:n 5'-pään leimaus

Huomautuksia käytöstä

1.RNA-liuoksen kuumentaminen ennen inkubaatiota Vaccinia Cappping Enzyme -entsyymin kanssa poistaa sekundäärisen rakenteen transkriptin 5'-päästä.Pidennä aikaa 60 minuuttiin transkriptioissa, joiden 5-päät tunnetaan hyvin.

2. Korkkireaktioihin käytetty RNA tulee puhdistaa ennen käyttöä ja suspendoida nukleaasivapaaseen veteen.EDTA:ta ei saa sisältää eikä liuoksessa saa olla suoloja.

3. 5'-pään leimaamiseksi GTP-kokonaiskonsentraation tulisi olla noin 1-3 kertaa mRNA:n molaarinen pitoisuus reaktiossa.

4. Reaktiojärjestelmän tilavuutta voidaan suurentaa tai pienentää todellisen tilanteen mukaan.