RTL-käänteistranskriptaasi
RTL-käänteistranskriptaasi on RNA-templaatista riippuvainen DNA-polymeraasi, josta puuttuu 3'→5'-eksonukleaasiaktiivisuus ja jolla on RNaasi H -aktiivisuutta.Tämä entsyymi voi käyttää RNA:ta templaattina syntetisoimaan komplementaarisen DNA-juosteen, jota voidaan soveltaa ensimmäisen juosteen cDNA-synteesiin, erityisesti RT-LAMP:lle (silmukkavälitteinen isoterminen monistus).Verrattuna RTL-käänteistranskriptaasi 1.0:aan herkkyys on merkittävästi parantunut, lämpöstabiilisuus on vahvempi ja reaktio 65 °C:ssa on vakaampi.RTL-käänteistranskriptaasia (glyseroliton) voidaan käyttää lyofilisoitujen valmisteiden, lyofilisoitujen RT-LAMP-reagenssien jne. valmistukseen.
Yksikön määritelmä
Yksi yksikkö sisältää 1 nmol dTTP:tä happosaostettavaan materiaaliin 20 minuutissa 50 °C:ssa käyttämällä poly(A)•oligo(dT)25:tä templaattialukkeena.
Komponentit
| Komponentti | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL-käänteistranskriptaasi (glyseroliton) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL-puskuri | 1,5 ml | 4 x 1,5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2 x 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Säilytysolosuhteet
Kuljetus alle 0°C ja säilytettävä -25°C ~ -15°C.
Laadunvalvonta
- Jäljellä oleva aktiivisuusEndonukleaasi:50 µl:n reaktio, joka sisälsi 1 µg λDNA:ta ja 15 yksikköä RTL2.0:aa inkuboituna 16 tuntia 37 ℃:ssa, osoittaa saman kuvion kuin negatiivinen kontrolli geelielektroforeesilla.
- Jäljellä oleva aktiivisuusEksonukleaasi:50 µl:n reaktio, joka sisälsi 1 µg HindⅢ-digestoitua λDNA:ta ja 15 yksikköä RTL2.0:aa inkuboituna 16 tuntia 37 ℃:ssa, osoittaa saman kuvion kuin negatiivinen kontrolli geelielektroforeesilla.
- Jäljellä oleva aktiivisuusNickase:50 µl:n reaktio, joka sisälsi 1 µg superkierteistä pBR322:ta ja 15 yksikköä RTL2.0:aa inkuboituna 4 tuntia 37 °C:ssa, osoittaa saman kuvion kuin negatiivinen kontrolli geelielektroforeesilla.
- Jäljellä oleva aktiivisuusRNaasi:10 µl:n reaktio, joka sisälsi 0,48 µg MS2-RNA:ta ja 15 yksikköä RTL2.0:aa inkuboituna 4 tuntia 37 °C:ssa, osoittaa saman kuvion kuin negatiivinen kontrolli geelielektroforeesilla.
- E. coli gDNA:Mitattu kanssaE. colitietyt HCD-tunnistussarjat, 15 RTL2.0-yksikköä sisältää vähemmän kuin 1E. coliperimä.
Reaktion asetukset
cDNA-synteesiprotokolla
| Komponentit | Äänenvoimakkuus |
| Templaatti-RNA a | valinnainen |
| Oligo(dT) 18-25 (50 uM) tai Random Primer -sekoitus (60 uM) | 2 μl |
| dNTP-sekoitus (10 mM kukin) | 1 μl |
| RNaasi-inhibiittori (40 U/ul) | 0,5 µl |
| RTL-käänteistranskriptaasi 2.0 (15U/uL) | 0,5 µl |
| 10×HC RTL-puskuri | 2 μl |
| Nukleaasiton vesi | Jopa 20 μl |
Huomautuksia:
1) Suositeltu kokonais-RNA:n annos on 1ng ~ 1 μg
2) Suositeltu mRNA-annos oli 50 ng - 100 ng
Thermo-pyöräily Edellytykset rutiinille reaktio:
| Lämpötila (°C) | Aika |
| 25 °Ca | 5 minuuttia |
| 55 °C | 10 minuuttiab |
| 80 °C | 10 minuuttia |
Huomautuksia:
1) Jos käytetään Random Primer Mixiä, inkubointivaihe 25 °C:ssa.
2) Jos käytetään kohdealukesekoitusta, inkubointivaihe 55 °C:ssa 10-30 minuuttia.
RT-LAMP-protokolla
| Komponentit | Äänenvoimakkuus | Lopullinen keskittyminen |
| Templaatti-RNA | valinnainen | ≥10 kopiota |
| dNTP-sekoitus (10 mM) | 3,5 μl | 1,4 mM |
| FIP/BIP-alukkeet (25×) | 1 μl | 1,6 μM |
| F3/B3 Primerit (25×) | 1 μl | 0,2 µM |
| LoopF/LoopB-alukkeet (25×) | 1 μl | 0,4 µM |
| RNaasi-inhibiittori (40 U/μl) | 0,5 µl | 20 U/reaktio |
| RTL-käänteistranskriptaasi 2.0 (15U/μl) | 0,5 µl | 7,5 U/reaktio |
| Bst V2 DNA -polymeraasi (8 U/μl) | 1 μl | 8 U/reaktio |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μl | 6 mM (yhteensä 8 mM) |
| 10 × HC RTL -puskuri (tai 10 × HC Bst V2 -puskuri) | 2,5 μl | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Nukleaasiton vesi | Jopa 25 μl | - |
Huomautuksia:
1) Sekoita vorteksoimalla ja sentrifugoi lyhyesti kerätäksesi.Inkubointi jatkuvassa lämpötilassa 65 °C:ssa 1 tunnin ajan.
2) Molemmat puskurit ovat yhteentoimivia ja niillä on sama koostumus.
Huomautuksia
1. Tämä tuote muodostaa valkoisen kiinteän aineen, kun sitä säilytetään -20 °C:ssa.Ota se -20°C:sta ja laita jäille noin 10 minuutiksi.Sulamisen jälkeen sitä voidaan käyttää ravistamalla ja sekoittamalla.
2. cDNA-tuotetta voidaan säilyttää -20 °C:ssa tai -80 °C:ssa tai käyttää välittömästi PCR-reaktioon.
3. RNase-kontaminaation estämiseksi pidä koealue puhtaana ja käytä puhtaita käsineitä ja naamioita käytön aikana.
