Plant direct PCR Kit
Kissanumero: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit soveltuu kasvien lehtien, siementen jne. suoraan monistamiseen, ja sitä voidaan käyttää polysakkarideja ja polyfenoleja sisältämättömien kasvinäytteiden korkean suorituskyvyn seulomiseen.Suunnattuun evoluutioon perustuvalla suoran amplifikaatio-DNA-polymeraasilla on parempi sietokyky kasveissa PCR-estäjille.Samaan aikaan se säilyttää korkean monistuskyvyn, joka sopii DNA-fragmenttien monistamiseen 5 kb:n sisällä.Sarjan ainutlaatuista lyysipuskuria A voidaan käyttää tuoreiden tai pakastettujen kasvikudosten hajottamiseen.Sitä on helppo käyttää ja lysaattia voidaan käyttää mallina monistukseen ilman puhdistusta.Järjestelmä sisältää suojaavia aineita, jotka mahdollistavat raakanäytteiden tehokkaan monistamisen toistuvan pakastuksen ja sulatuksen jälkeen.2 × Plant Direct Master Mix tarvitsee vain lisätä alukkeita ja mallineita monistusreaktion suorittamiseksi, mikä vähentää pipetointitoimintoja ja parantaa havaitsemisen suorituskykyä ja tulosten toistettavuutta.
Komponentit
| Komponentit | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1,25 ml | 4 × 1,25 ml |
| Kasvien suora lyysipuskuri A | 5 ml | 20 ml |
| Kasvien suora lyysipuskuri B* | 5 ml | 20 ml |
*Plant Direct Lysis Buffer B on valinnainen reagenssi, jota käytetään Plant Direct Lysis -puskurin A neutralointiin näytteiden säilytysajan pidentämiseksi.Sitä voidaan käyttää todellisen tilanteen mukaan.
Varastointiolosuhteet
2 × Plant Direct Master Mix, säilytä -30 ~ -15 ℃ ja vältä toistuvaa jäätymistä ja sulattamista;Istuta suora lyysipuskuri, säilytä -30 ~ -15 ℃ tai 2 ~ 8 ℃.
Kokeiluprosessi
Näytteen käsittely–Kasvin lehti
Suora menetelmä:On suositeltavaa käyttää nuoria lehtiä.Käytä rei'itystä, jonka halkaisija on kiinteä 0,5–3 mm, jotta saat pienen ja tasaisen näytteen, ja lisää sitten näyte suoraan PCR-järjestelmään (suositus on 50 μl).Huomaa, että näyte on PCR-liuoksessa eikä putken seinämää vasten.Jos pitkien fragmenttien ja monimutkaisten näytteiden monistamiseen käytetään suoraa PCR:ää, halkaisijaltaan pienemmän (0,5–1 mm) näytteen käyttö templaattina voi auttaa saavuttamaan parempia tuloksia.
Jauhamisen lyysimenetelmä:On suositeltavaa käyttää nuoria lehtiä.Ota pieni pala lehtiä (halkaisijaltaan noin 1–3 mm), aseta se 20 μl:aan Plant Direct Lysis Buffer Ab:ta ja jauha sitä mahdollisimman paljon (tämä vaihe voidaan tehdä puristamalla lehtiä 100 μl:n pipetin kärjellä näytteen muussaamiseen).Jos käytetään suurempia määriä lehtikudosta (ei yli 7 mm), lisää laimennuspuskurin tilavuutta 50 μl:aan.Kun lehdet on jauhettu, liuoksen tulisi näyttää vihreältä.Lisää lyhyen sentrifugoinnin jälkeen 1 μl supernatanttia PCR-järjestelmään reaktiotemplaattina.
Terminen lyysimenetelmä:On suositeltavaa käyttää nuoria lehtiä.Ota pieni pala lehtiä (halkaisijaltaan noin 1–3 mm), aseta se 20 μl:aan Plant Direct Lysis Buffer A:ta ja kuumenna 95 °C:ssa 5–10 minuuttia.Hajotusaikaa voidaan pidentää sopivasti vaikeasti hajotettaville lehdille (enintään 20 min).Jos käytetään suurempia määriä lehtikudosta (ei yli 7 mm), lisää laimennuspuskurin tilavuus 50 μl:aan.Kuumentamisen jälkeen sentrifugoi lyhyesti ja lisää 1 μl supernatanttia PCR-järjestelmään reaktiomallinab.
Näytteen käsittely– Istuta siemeniä
Jauhamisen lyysimenetelmä:Leikkaa veitsellä halkaisijaltaan 5 mm:n siemenet, lisää ne 100 μl:aan Plant Direct Lysis -puskuria A ja jauha näyte pipetin kärjellä tai muilla työkaluilla.Vorteksoi hetken ja anna seistä huoneenlämmössä 3-5 min.Varmista, että siemennäyte on upotettu laimennuspuskuriin.Lisää lyhyen sentrifugoinnin jälkeen 1 μl supernatanttia PCR-järjestelmään reaktiotemplaatiksi.
Terminen lyysimenetelmä:Leikkaa veitsellä halkaisijaltaan 5 mm:n siemenet, lisää ne 100 μl:aan Plant Direct Lysis -puskuria A ja kuumenna 95°C:ssa 5–10 minuuttia.Hajotusaikaa voidaan pidentää sopivasti vaikeasti hajotettaville lehdille (enintään 30 min).Kuumentamisen jälkeen sentrifugoi lyhyesti ja lisää 1 μl supernatanttia PCR-järjestelmään reaktiomallinab.
a.Sopivan kokoisten näytteiden leikkaamiseen voidaan käyttää myös saksia tai muita työkaluja;Jos rei'itys tai sakset käytetään uudelleen, ne tulee puhdistaa 2-prosenttisella natriumhypokloriittiliuoksella ennen jokaista käyttöä, jotta vältetään näytteiden välinen ristikontaminaatio.
b.Varmista, että Plant Direct -lyysipuskuri on täysin sulanut ennen käyttöä.Jos puskuri on viskoosia tai siinä on saostumia, se voidaan lämmittää 37 ℃:een, jotta se sulaa kokonaan ennen käyttöä.
c.Templaatin tilavuutta reaktiojärjestelmässä voidaan säätää sopivasti lisätyn kasvimateriaalin ja laimentimen tilavuuden eron mukaan.
Istuta suora lyysipuskuri
Tämän tuotteen sisältämä Plant Direct Lysis -puskuri A on tiukasti optimoitu vapauttamaan useimpien kasvikudosten genomi ja se soveltuu raakakasvien lyhytaikaiseen varastointiin 4 ℃:ssa.Jos näytettä on säilytettävä pidempään (esim. 1-2 kuukautta), on suositeltavaa siirtää supernatantti uuteen EP-putkeen ja säilyttää -20 ℃:ssa.Jotta näytteitä säilytetään vakaammin, lisää siirrettyyn supernatanttiin yhtä suuri määrä Plant Direct Lysis -puskuria B, sekoita hyvin ja säilytä -20 ℃:ssa.Stabiili säilytysaika vaihtelee kasvinäytteiden ja -tilojen mukaan.
Reaktiojärjestelmä
| ddH2O | 20,0 µl:aan | 50,0 µl:ksi |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Pohja 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Pohja 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Kasvin lehti/raakauutteenäyte(Katso kohtaa Näytteen käsittely) | 0,5-3 mm lehtikiekko/x µl | 0,5-3 mm lehtikiekko/x µl |
a.Se sisältää Mg2+loppukonsentraatiolla 2 mM.
b.On suositeltavaa käyttää loppupitoisuutta 0,4 μM jokaiselle alukkeelle.Alukkeiden liiallinen käyttö johtaa lisääntyneeseen epäspesifiseen monistukseen.
c.Käytettävän näytteen määrää voidaan säätää todellisen tilanteen mukaan.Yhdessä reaktiossa käytettyä määrää lyysaamattoman raakanäytteen määrää voidaan säätää välillä 2-20 % reaktion kokonaistilavuudesta.Liian suuren näytteen käyttäminen voi aiheuttaa vahvistusvirheen.
Reaktio-ohjelma
| Askeleet | Lämpötila | Aika |
| Alkudenaturaatio | 98℃ | 5 min |
| Denaturaatio | 95℃ | 10 sek |
| Hehkutus | 58 ~ 72 ℃ | 15 sek |
| Laajennus | 72℃ | 30 sek |
| Lopullinen laajennus | 72℃ | 5 min |
a.Alkudenaturaatio (98 ℃, 5 min) edistää kasvikudoksen hajoamista vapauttaen genomista DNA:ta, jota voidaan käyttää PCR-monistukseen.Älä lyhennä aikaa tai alenna lämpötilaa.
b.On suositeltavaa asettaa se yhtä suureksi kuin alukkeen Tm-arvo tai 2 ~ 4℃ korkeampi kuin Tm-arvo.Tässä tuotteessa käytetty suoran monistus-DNA-polymeraasi eroaa tavanomaisesta Taq-DNA-polymeraasista, ja sillä on erityisiä vaatimuksia reaktion pariutumislämpötilalle ； Korkean pariutumislämpötilan käyttö voi tehokkaasti vähentää epäspesifistä monistumista ja parantaa monistuksen tehokkuutta.Monimutkaisten mallien kohdalla tehokas vahvistus voidaan saavuttaa säätämällä hehkutuslämpötilaa ja pidentämällä pidennysaikaa.
c.Jos vahvistustuotteen pituus on ≤1 kb, laajennusajaksi asetetaan 30 s/kb;jos vahvistustuotteen pituus on > 1 kb, laajennusajaksi asetetaan 60 s/kb.
d.Monimutkaisille näytteille tai näytteille, joilla on alhainen amplifikaatiosaanto, syklien lukumäärä voidaan nostaa sopivasti 40-50 sykliin.
Sovellukset
Se soveltuu kasvikudosten suoraan monistamiseen ja polysakkarideja ja polyfenoleja sisältämättömien kasvinäytteiden suuren suorituskyvyn seulomiseen.
Huomautuksia
Vain tutkimuskäyttöön.Ei käytettäväksi diagnostisissa toimenpiteissä.
1. Raakakasvin monistuksessa tai suorassa monistuksessa on suositeltavaa käyttää puhdistettua genomista DNA:ta positiivisena kontrollina ennen kokeen aloittamista varmistaakseen, että järjestelmä, alukkeet ja toiminnot ovat oikein.
2. Tässä pakkauksessa käytetyllä suoran monistus-DNA-polymeraasilla on vahva oikolukuaktiivisuus.Jos TA-kloonaus on suoritettava, on suositeltavaa puhdistaa DNA ennen adeniinin lisäämistä.
3. Pohjamaalin suunnitteluopas:
a.On suositeltavaa, että pohjamaalin 3′-pään viimeinen pohja on G tai C.
b.Peräkkäisiä epäsopivuuksia tulee välttää kahdeksassa viimeisessä emäksessä alukkeen 3′ päässä.c.Vältä hiusneularakenteita pohjamaalin 3′ päässä.
d.Eteenpäin suuntautuvan ja käänteisen alukkeen Tm-arvon erot eivät saa olla suurempia kuin 1 ℃ ja Tm-arvo tulee säätää välille 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5:tä suositellaan Tm-arvon laskemiseen).
e.Ylimääräisiä ylimääräisiä alukesekvenssejä, jotka eivät täsmää templaatin kanssa, ei pitäisi ottaa mukaan laskettaessa alukkeen Tm-arvoa.
f.Pohjusteen GC-pitoisuuden suositellaan olevan 40-60 %.
g.A:n, G:n, C:n ja T:n kokonaisjakauman alukkeessa tulisi olla mahdollisimman tasainen.Vältä käyttämästä alueita, joissa on korkea GC- tai AT-pitoisuus.
h.Vältä 5 tai useamman emäksen komplementaaristen sekvenssien läsnäoloa joko alukkeen sisällä tai kahden alukkeen välillä ja vältä 3 tai useamman emäksen komplementaaristen sekvenssien läsnäoloa kahden alukkeen 3'-päässä.
i.Käytä NCBI BLAST -toimintoa tarkistaaksesi alukkeen spesifisyyden epäspesifisen monistumisen estämiseksi.
