PNGase F
Peptidi-N-glykosidaasi F (PNGaasi F) on tehokkain entsymaattinen menetelmä lähes kaikkien N-sitoutuneiden oligosakkaridien poistamiseksi glykoproteiineista.PNGaasi F on amidaasi, joka katkaisee N-kytketyistä glykoproteiineista korkean mannoosipitoisuuden, hybridi- ja kompleksioligosakkaridien sisimpien GlcNAc- ja asparagiinitähteiden välillä.
Sovellus
Tämä entsyymi on hyödyllinen hiilihydraattijäämien poistamiseen proteiineista.
Valmistelu ja määrittely
| Ulkomuoto | Väritön Neste |
| Proteiinin puhtaus | ≥ 95 % (SDS-PAGEsta) |
| Toiminta | ≥500 000 U/ml |
| Eksoglykosidaasi | Toimintaa ei havaittu (ND) |
| Endoglykosidaasi F1 | ND |
| Endoglykosidaasi F2 | ND |
| Endoglykosidaasi F3 | ND |
| Endoglykosidaasi H | ND |
| Proteaasi | ND |
Ominaisuudet
| EY-numero | 3.5.1.52(Rekombinantti mikro-organismista) |
| Molekyylipaino | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektrinen piste | 8. 14 |
| Optimaalinen pH | 7,0-8,0 |
| Optimaalinen lämpötila | 65 °C |
| Substraatin spesifisyys | Glykosidisidosten pilkkominen GlcNAc:n ja asparagiinitähteiden välillä Kuva 1 |
| Tunnustussivustot | N-kytketyt glykaanit, elleivät ne sisällä α1-3-fukoosia Kuva 2 |
| Aktivaattorit | DTT |
| Inhibiittori | SDS |
| Säilytyslämpötila | -25 ~ -15 ℃ |
| Lämmön poisto | 20 µl:n reaktioseos, joka sisältää 1 µl PNGaasi F:tä, inaktivoidaan inkuboimalla 75 °C:ssa 10 minuuttia. |
Kuva 1 PNGaasi F:n substraattispesifisyys
Kuva 2 PNGase F:n tunnistuspaikat.
Kun sisäiset GlcNAc-tähteet on kytketty α1-3-fukoosiin, PNGaasi F ei voi pilkkoa N-kytkettyjä oligosakkarideja glykoproteiineista.Tämä muunnos on yleinen kasveissa ja joissakin hyönteisten glykoproteiineissa.
Ckomponentteja
|
| Komponentit | Keskittyminen |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×glykoproteiinidenaturoiva puskuri | 1000 µl |
| 3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10 % NP-40 | 1000 µl |
Yksikön määritelmä
Yksi yksikkö (U) määritellään entsyymimääräksi, joka tarvitaan poistamaan >95 % hiilihydraatista 10 ug:sta denaturoitua RNaasi B:tä 1 tunnissa 37 °C:ssa 10 ui:n kokonaisreaktiotilavuudessa.
Reaktioolosuhteet
1. Liuota 1-20 µg glykoproteiinia deionisoituun veteen, lisää 1 µl 10×glykoproteiinidenaturoivaa puskuria ja H2O:ta (tarvittaessa) saadaksesi 10 µl:n kokonaisreaktiotilavuuden.
2.Inkuboi 100°C:ssa 10 minuuttia, jäähdytä jäillä.
3.Lisää 2 µl 10 × GlycoBuffer 2:ta, 2 µl 10 % NP-40:tä ja sekoita.
4.Lisää 1-2 µl PNGaasi F:tä ja H:ta2O (tarvittaessa) 20 µl:n kokonaisreaktiotilavuuden saamiseksi ja sekoita.
5.Inkuboi reaktiota 37 °C:ssa 60 minuuttia.
6.SDS-PAGE-analyysiin tai HPLC-analyysiin.
