mRNA Cap2'-O-metyylitransferaasi

mRNA Cap 2'-O-metyylitransferaasi johdettiin rekombinantista E. coli -kannasta, joka kantaa vaccinia mRNA Cap 2'-O-metyylitransferaasin geeniä.Tämä entsyymi lisää metyyliryhmän ensimmäisen nukleotidin 2'-O-asemaan cap-rakenteen vieressä RNA:n 5'-päässä. Entsyymi käyttää S-adenosyylimetioniinia (SAM) metyyliluovuttajana capped RNA:n (cap) metylointiin. -0), jolloin tuloksena on cap-1 -rakenne.

Cap1-rakenne voi lisätä translaation tehokkuutta parantamalla mRNA:n ilmentymistä transfektio- ja mikroinjektiokokeissa. Tämä entsyymi vaatii erityisesti RNA:ta, jossa on m7GpppN cap substraattina.Se ei voi hyödyntää RNA:ta, jonka 5'-päässä on pN, ppN, pppN tai GpppN.Korjattu RNA voidaan valmistaa in vitro -transkriptiolla käyttämällä cap-analogia tai entsymaattisella cappingilla käyttämällä Vaccinia Cappping Enzymeä.

Komponentit

mRNA Cap 2'-O-metyylitransferaasi (50 U/μl)

10×Capping Reaction Buffer

Varastointi

-25 ～- 15 ℃ varastointia varten (Vältä toistuvia pakastus-sulatusjaksoja)

Tallennuspuskuri

20 mM Tris-HCl (pH 8,0 ， 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glyseroli.

Yksikön määritelmä

Yksi yksikkö määritellään entsyymimääräksi, joka tarvitaan metyloimaan 10 pmoolia 80 nt capped RNA-transkriptiä 1 tunnissa 37 °C:ssa.

Laadunvalvontamääritykset

Eksonukleaasi:50 U mRNA Cap 2' -O-metyylitransferaasia 1 μg λ-Hind III -digesti-DNA:n kanssa 37 °C:ssa 16 tunnin ajan ei tuota hajoamista, kuten määritetään agaroosigeelielektroforeesilla.

Endonukleaasi: 50 U mRNA Cap 2' -O-metyylitransferaasia 1 µg:n λDNA:n kanssa 37 °C:ssa 16 tunnin ajan ei tuota hajoamista agaroosigeelielektroforeesilla määritettynä.

Nickase: 50 U mRNA Cap 2' -O-metyylitransferaasia 1 µg pBR322:n kanssa 37 °C:ssa 16 tunnin ajan ei tuota hajoamista, kuten on määritetty agaroosigeelielektroforeesilla.

RNaasi: 50 U mRNA Cap 2' -O-metyylitransferaasia 1,6 µg MS2 RNA:n kanssa 4 tunnin ajan 37 °C:ssa ei tuota hajoamista agaroosigeelielektroforeesilla määritettynä.

E. coli DNA: 50 U mRNA Cap 2' -O-metyylitransferaasia seulotaanE. coli genomista DNA:ta käyttäen TaqMan qPCR:ää, jossa on spesifisiä alukkeitaE. coli 16S rRNA-lokus.TheE. coli genominen DNA:n kontaminaatio on =1E. coli perimä.

Bakteeri Endotoksiini: LAL-testi, Kiinan farmakopean IV 2020 painoksen mukaan, geelirajatestimenetelmä, yleinen sääntö (1143).Bakteerien endotoksiinipitoisuuden tulee olla =10 EU/mg.

Reaktiojärjestelmä ja olosuhteet

1. Yhdistä sopiva määrä Capped RNA:ta ja RNaasi-vapaata H2O:ta 1,5 ml:n mikrofugiputkessa lopulliseen tilavuuteen 16,0 µl.

2. Kuumenna 65 ℃:ssa 5 minuuttia ja sen jälkeen jäähauteessa 5 minuutin ajan.

3. Lisää seuraavat komponentit määritetyssä järjestyksessä (Capped RNA:n metylointia varten

alle 10

* 10 x korkkireaktiopuskuri: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 °C), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkuboi 37 ℃:ssa 1 tunti (alle 200 nt:n kohdefragmentille suositellaan 2 tunnin inkubointia).

Sovellukset

Parantaa mRNA:n ilmentymistä mikroinjektiokokeiden ja transfektiokokeiden aikana.

Huomautuksia käytöstä

1. Ennen reaktiota RNA tulee puhdistaa ja liuottaa nukleaasivapaaseen veteen, kaikki liuokset eivät saa sisältää EDTA:ta tai ioneja.

2. On suositeltavaa kuumentaa näyte-RNA:ta 65℃:ssa 5 minuuttia ennen reaktiota sekundaarirakenteen poistamiseksi transkriptin 5'-päästä.Se voidaan pidentää 10 minuuttiin monimutkaisen 5 ´ -pääterakenteen tapauksessa.