M-MLV-käänteistranskriptaasi
RevScript-käänteiskopioija saadaan geenitekniikan avulla.Sillä on korkeampi cDNA-synteesikyky, lämpöstabiilius ja reaktiolämpötilaraja (jopa 60 °C).Syntetisoitu cDNA-tuote on enintään 10 kb.Se tehostaa templaattien affiniteettia ja soveltuu monimutkaisen sekundaarirakenteen tai vähän kopiogeenejä omaavien RNA-templaattien käänteistranskriptioon.
Komponentit
| Komponentti | HC2003B (10 000U) | HC2003B (5*10 000U) | HC2003B (200 000U) |
| RevScript-käänteistranskriptaasi (200U/μL) | 50 µl | 5 × 50 μl | 1 ml |
| 5 × RevScript-puskuri | 250 µl | 1,25 ml | 5 ml |
Säilytysolosuhteet
Tämä tuote tulee säilyttää -25°C - -15°C:ssa 2 vuoden ajan.
Yksikön määritelmä
Yksi yksikkö sisältää 1 nmol dTTP:tä happoon liukenemattomaan materiaaliin 10 minuutissa 37 °C:ssa käyttäen Oligo(dT):tä alukkeina.
Reaktion asetukset
1.RNA-templaatin denaturointi (Tämä vaihe on valinnainen, RNA-templaatin denaturointi auttaa avaamaan sekundaarirakenteita, mikä parantaa ensimmäisen juosteen cDNA:n saantoa.)
| Komponentit | Äänenvoimakkuus (μL) |
| RNaasi-vapaa ddH2O | 13 asti |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/l) tai Random Primer (50 μmol/L) Tai geenispesifiset alukkeet (2 μmol/l) | 1 |
| tai 1 | |
| tai 1 | |
| RNA-templaatti | X a |
Huomautuksia:
1) a: Kokonais-RNA: 1-5 ug tai mRNA: 1-500 ng
2) Inkuboidaan 65 °C:ssa 5 minuuttia, sitten siirretään heti jäille jäähdyttämään 2 minuuttia.Lyhyt sentrifugointi reaktionesteen keräämiseksi, lisää käänteistranskription reaktioliuos seuraavan taulukon mukaisesti.Pipetoi varovasti sekoittaaksesi.
1.Reaktioseoksen valmistus (tilavuus 20 µl)
| Komponentit | Äänenvoimakkuus (μL) |
| Edellisen vaiheen sekoitus | 13 |
| 5 × Puskuri | 4 |
| dNTP-seos (10 nmol/l) | 1 |
| Käänteistranskriptaasi (200 U/μl) | 1 |
| RNaasi-inhibiittori (40 U/μl) | 1 |
1.Suorita reaktio seuraavissa olosuhteissa:
| Lämpötila (°C) | Aika |
| 25 °Ca | 5 minuuttia |
| 42 °Cb | 15-30 minuuttia |
| 85 °Cc | 5 minuuttia |
Huomautuksia:
1) a.Inkubointia 25 °C:ssa 5 minuutin ajan vaaditaan vain satunnaisten heksameerien käyttämiseksi.Ohita tämä vaihe, kun käytät Oligoa (dT)18tai geenispesifinen aluke.
2) b.Suositeltu käänteistranskription lämpötila on 42°C. Templateille, joissa on monimutkaiset sekundaarirakenteet tai korkea GC-pitoisuus, on suositeltavaa nostaa reaktiolämpötila 50-55°C:een.
3) c.Kuumennus 85 °C:ssa 5 minuuttia käänteiskopioijaentsyymin inaktivoimiseksi.
4) Tuotetta voidaan käyttää suoraan PCR- tai qPCR-reaktioissa tai säilyttää -20 °C:ssa lyhytaikaista varastointia varten.Suosittelemme, että tuotteet asetetaan kohdalleen ja säilytetään -80°C:ssa pitkäaikaista säilytystä varten.Vältä toistuvaa jäätymistä ja sulattamista.
5) Tuote soveltuu yksivaiheiseen RT-qPCR:ään, suositellaan 10-20 U käänteiskopioijaentsyymin lisäämistä jokaista 25μL reaktiojärjestelmää kohti tai käänteiskopioijaentsyymin määrää lisätään asteittain todellisen tilanteen mukaan.
Huomautuksia
1.Pidä koealue puhtaana;Puhtaita käsineitä ja naamioita tulee käyttää käytön aikana.Kaikkien kokeessa käytettyjen kulutustarvikkeiden tulee olla RNaasivapaita RNaasikontaminaation estämiseksi.
2.Kaikki toimenpiteet tulee suorittaa jäillä RNA:n hajoamisen estämiseksi.
3.Korkealaatuisia RNA-näytteitä suositellaan käänteistranskription korkean tehokkuuden varmistamiseksi.
4.Tämä tuote on tarkoitettu vain tutkimuskäyttöön.
5.Käytä turvallisuutesi vuoksi laboratoriotakkeja ja kertakäyttökäsineitä.
