Kaksijuosteinen RNA (dsRNA) ELISA KIT

Tämä pakkaus on entsyymikytketty immunosorbenttimääritys (ELISA), joka on kytketty biotiini-streptavidiinijärjestelmään yli 60 emäsparin (bp) pituisen dsRNA:n kvantitatiiviseen mittaamiseen sekvenssistä riippumatta.Levy on esipäällystetty anti-dsRNA-vasta-aineella.näytteessä oleva dsRNA lisätään ja sitoutuu kuoppiin päällystettyihin vasta-aineisiin.Ja sitten lisätään biotinyloitua anti-dsRNA-vasta-ainetta ja se sitoutuu näytteessä olevaan dsRNA:han.Pesun jälkeen lisätään HRP-Streptavidiinia ja se sitoutuu biotinyloituun anti-dsRNA-vasta-aineeseen.Inkuboinnin jälkeen sitoutumaton HRP-streptavidiini pestään pois.Sitten lisätään TMB-substraattiliuosta ja katalysoidaan HRP:llä, jolloin saadaan sininen värituote, joka muuttui keltaiseksi happaman pysäytysliuoksen lisäämisen jälkeen.Keltaisen tiheys on verrannollinen levylle siepatun dsRNA:n tavoitemäärään.Absorbanssi mitataan 450 nm:ssä.

Sovellus

Tämä pakkaus on jäännös-dsRNA:n kvantitatiiviseen mittaamiseen.

Sarjan komponentit

Varastointi ja vakaus

1. Käyttämätön sarja: Koko sarja voidaan säilyttää 2–8 ℃:n lämpötilassa säilyvyysajan aikana.Vahvaa valoa tulee välttää säilytysvakauden vuoksi.

2. Käytetty pakkaus: Kun mikrolevy on avattu, peitä käyttämättömät kuopat levynsulkimella ja palaa kuivausainepakkauksen sisältävään foliopussiin, sulje foliopussi vetoketjulla ja palauta lämpötila 2-8 ℃ mahdollisimman pian käytön jälkeen.Muut reagenssit tulee palauttaa 2-8 ℃:seen mahdollisimman pian käytön jälkeen.

Tarvittavat materiaalit, mutta niitä ei toimiteta

1. Mikrolevylukija 450±10 nm suodattimella (parempi, jos se pystyy havaitsemaan aallonpituuksilla 450 ja 650 nm).

2. Mikrolevyravistelija.

3. RNaasi-vapaat kärjet ja sentrifugiputket.

Toiminnan vuokaavio

Ennen kuin aloitat

1. Ota kaikki pakkauksen osat ja näytteet huoneenlämpöön (18-25 ℃) ennen käyttöä.Jos sarjaa ei käytetä kerralla loppuun, ota pois vain liuskat ja reagenssit tätä koetta varten ja jätä loput nauhat ja reagenssit vaadittuun kuntoon.

2. Pesupuskuri: laimenna 40 ml 20-kertaista väkevää pesupuskuria 760 ml:lla deionisoitua tai tislattua vettä valmistaaksesi 800 ml 1-kertaista pesupuskuria.

3. Standardi: pyöritä tai sentrifugoi varastoliuosta lyhyesti ennen käyttöä.Neljän toimitetun standardin pitoisuus on 5 ng/μL.UTP- ja pUTP-dsRNA-standardeja varten laimenna kantaliuos STE-puskurilla arvoon 1,0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0,0156,0 pg/μL standardikäyrän piirtämiseksi.N1-Me-pUTP dsRNA-standardeja varten laimenna kantaliuos STE-puskurilla arvoon 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL standardikäyrän piirtämiseksi.5-OMe-UTP dsRNA-standardin osalta laimenna kantaliuos STE-puskurilla arvoon 4,2,1,0,5, 0,25,0,125, 0,0625, 0pg/μL standardikäyrän piirtämiseksi.Suosittelemme, että standardit voidaan laimentaa seuraavilla kaavioilla:

4. Biotinyloitu detektiovasta-aine ja HRP-streptavidiinin työliuos: pyöritä tai sentrifugoi varastoliuosta lyhyesti ennen käyttöä.Laimenna ne käyttöpitoisuuteen laimennuspuskurilla.

5. TMB-substaatti: ime tarvittava annos liuosta steriloiduilla kärjillä äläkä kaada jäännösliuosta uudelleen injektiopulloon.TMB-substraatti on herkkä valolle, älä altista TMB-substraattia valolle pitkäksi aikaa.

Protokollan käyttäminen

1. Määritä määritykseen tarvittavien liuskojen lukumäärä.Aseta nauhat kehyksiin käyttöä varten.Loput levyliuskat, joita ei käytetä tässä määrityksessä, tulee pakata uudelleen pussiin, jossa on kuivausainetta.Sulje pussi tiiviisti jääkaapissa säilytystä varten.

2. Lisää 100 μL kutakin standardi-, nolla- ja näytteiden laimennoksia asianmukaisiin kuoppiin.Peitä levytiivisteellä.Inkuboidaan 1 tunti huoneenlämmössä ravistellen 500 rpm.Näytteet tulee laimentaa STE-puskurilla sopivaan pitoisuuteen tarkan määrityksen varmistamiseksi.

3. Pesuvaihe: Imu liuos ja pese 250 µl pesupuskuria jokaiseen kuoppaan ja anna sen seistä 30 s.Hävitä pesupuskuri kokonaan napsauttamalla levy imukykyiselle paperille.Pese kokonaan 4 kertaa.

4. Lisää 100 μl biotinyloitua detektiovasta-aineen työliuosta kuhunkin kuoppaan.Peitä levytiivisteellä.Inkuboidaan 1 tunti huoneenlämmössä ravistellen 500 rpm.

5. Toista pesuvaihe.

6. Lisää 100 µl HRP-streptavidiinin työliuosta kuhunkin kuoppaan.Peitä levytiivisteellä.Inkuboi 30 minuuttia huoneenlämmössä ravistellen 500 rpm.

7. Toista pesuvaihe uudelleen.

8. Lisää 100 μL TMB-substraattiliuosta kuhunkin kuoppaan.Peitä levytiivisteellä.Inkuboi 30 minuuttia huoneenlämpötilassa Suojaa valolta.Neste muuttuu siniseksi lisäämällä substraattiliuosta.

9. Lisää 50 μL pysäytysliuosta kuhunkin kuoppaan.Neste muuttuu keltaiseksi lisäämällä pysäytysliuosta.Käytä sitten mikrolevylukijaa ja suorita mittaus 450 nm:ssä välittömästi.

Tulosten laskeminen

1. Laske kunkin standardin, kontrollin ja näytteen kaksoislukemien keskiarvo ja vähennä keskimääräinen nollastandardin optinen tiheys.Muodosta standardikäyrä, jossa absorbanssi on pystyakselilla (Y) ja dsRNA-pitoisuus vaaka-akselilla (X）).

2. On suositeltavaa suorittaa laskenta tietokonepohjaisella käyränsovitusohjelmistolla, kuten curve expert 1.3 tai ELISA Calc 5 tai 4 parametrin epälineaarisessa sovitusmallissa.

Esitys

1. Herkkyys:

havaitsemisen alaraja: ≤ 0,001 pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA:lle), ≤ 0,01 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA:lle).

kvantifioinnin alaraja: 0,0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA:lle), 0,0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA:lle), 0,0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA:lle).

2. Tarkkuus: Intra-Assayn CV ≤10 %, Inter-Assay CV ≤10 %

3. Palautus: 80 % ~ 120 %

4. Lineaarisuus: 0,0156–0,5 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA:lle) 0,0312–1 pg/μL (N1-Me-pUTP dsRNA:lle), 0,0625–1 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA:lle).

Pohdintoja

1. TMB-reaktiolämpötila ja -aika ovat kriittisiä, valvo niitä tiukasti ohjeiden mukaisesti.

2. Hyvän määrityksen toistettavuuden ja herkkyyden saavuttamiseksi levyjen asianmukainen pesu ylimääräisten reagoimattomien reagenssien poistamiseksi on välttämätöntä.

3. Kaikki reagenssit on sekoitettava perusteellisesti ennen käyttöä ja vältettävä epäpuhtauksia näytteen tai reagenssien lisäyksen aikana.

4. Jos väkevöityyn pesupuskuriin (20x) on muodostunut kiteitä, lämmitä 37 ℃:seen ja sekoita varovasti, kunnes kiteet ovat täysin liuenneet.

5. Vältä natriumatsidia (NaN3) sisältävien näytteiden määrittämistä, koska se voi tuhota HRP-aktiivisuuden ja johtaa dsRNA:n määrän aliarviointiin.

6. Vältä RNaasi-kontaminaatiota määrityksen aikana.

7. Standardi/näyte, detektiovasta-aine ja SA-HRP voidaan suorittaa myös huoneenlämpötilassa ravistamatta, mutta tämä voi aiheuttaa havaitsemisherkkyyden alenemisen yksikertaiseksi.Tässä tapauksessa suosittelemme, että UTP- ja pUTP-dsRNA-standardit laimennettaisiin pitoisuudesta 2pg/μL, N1-Me-pUTP-dsRNA-standardit laimennettaisiin 4pg/μL:sta ja 5-OMe-UTP-dsRNA-standardit laimennettaisiin 8 pg/μL:sta.Lisäksi inkuboi HRP-streptavidiinin työliuosta 60 minuuttia huoneenlämmössä.Älä käytä pulloravistinta, koska pulloravistin voi aiheuttaa epätarkkoja tuloksia.

Tyypillinen tulos

1. Vakiokäyrätiedot

2. Vakiokäyrän laskenta

3. Suojakalvon tunnistusalue: 0,0312 - 1 pg/μL