5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Cat nro: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) on erittäin vakaa yhden putken koetinpohjainen seos, joka soveltuu yksivaiheiseen käänteistranskriptioon ja kvantitatiiviseen PCR:ään (qRT-PCR).Se tukee pohjusteiden ja koettimien esisekoitusta ja pysyy vakaana pitkän varastoinnin jälkeen alhaisessa lämpötilassa.Testattava näyte voidaan lisätä suoraan käytön aikana ilman ylimääräistä putken avaamista/pipetointia.Tämä tuote sisältää komponentteja, kuten kuumakäynnistys-DNA-polymeraasi, M-MLV, lämpölabiili urasiili-DNA-glykosylaasi (TS-UNG), RNaasi-inhibiittori, MgCl2dNTP:t (dUTP:llä dTTP:n sijasta) ja stabilisaattoreita.Geneettisesti muunnetun nopean amplifikaation käänteiskopioijaentsyymin ja DNA-polymeraasin avulla on mahdollista suorittaa PCR-monistaminen 20-40 minuutissa.Tämä reagenssi käyttää erityistä puskuria qPCR:ään, jossa on sekoitettuja entsyymejä, anti-inhibitorista monistusta ja UNG-entsyymiä.Siksi se voi saada aikaan hyvän kohdegeenien monistumisen ja estää PCR-jäännös- ja aerosolisaasteen aiheuttaman väärän monistumisen.Tämä reagenssi on yhteensopiva useimpien valmistajien, kuten Applied Biosystemsin, Eppendorfin, Bio-Radin ja Rochen, fluoresenssikvantitatiivisten PCR-laitteiden kanssa.
Komponentti
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5 × Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Varastointiolosuhteet
Kaikki komponentit tulee säilyttää -20 ℃:ssa pitkäaikaista varastointia varten ja 4℃:ssa enintään 3 kuukauden ajan.Sekoita huolellisesti sulatuksen jälkeen ja sentrifugoi ennen käyttöä.Vältä toistuvaa jäätymistä ja sulattamista.
qRT-PCR-reaktiojärjestelmän valmistelu
| Komponentit | 25μLJärjestelmä | 50μLJärjestelmä | Lopullinen keskittyminen |
| 5 × Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μl | 10 μl | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 μl | 2μl | 1× |
| 25 × Primer-Probe Mixa | 1 μl | 2μl | 1× |
| Templaatti-RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Jopa 25 μl | Jopa 50 μl | – |
1) a. Alukkeen lopullinen pitoisuus on yleensä 0,2 μM.Parempien tulosten saamiseksi alukkeen pitoisuus voidaan optimoida alueella 0,2-1 μM.Yleensä koettimen pitoisuus voidaan optimoida alueella 0,1-0,3 μM.
2) b. Nopeaa PCR-menetelmää käytettäessä alukkeiden ja koettimien pitoisuuden lisääminen voi johtaa parempiin monistustuloksiin, ja niiden suhde tulisi optimoida vastaavasti.
3) Eri tyyppiset näytteet sisältävät erityyppisiä ja -sisältöisiä inhibiittoreita ja kohdegeenin kopiomäärää.Näytteen tilavuus on otettava huomioon todellisen tilan mukaan.Laimenna näyte tarvittaessa nukleaasivapaalla vedellä tai TE-puskurilla.
Reaktio Cehtoja
| Säännöllinen PCR-menettely | Nopea PCR-menettely | ||||||
| Menettely | Temp. | Aika | Kierrä | Menettely | Temp. | Aika | Kierrä |
| Käänteinen transkriptio | 50℃ | 10-20 minuuttia | 1 | Käänteinen transkriptio | 50℃ | 5 minuuttia | 1 |
| Polymeraasi Aktivointi | 95℃ | 1-5 minuuttia | 1 | Polymeraasi Aktivointi | 95℃ | 30s | 1 |
| Denaturaatio | 95℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturaatio | 95℃ | 1-3s | 40-50 |
| Hehkutus ja Laajennus | 56-64℃ | 20-60 luvulla | Hehkutus ja Laajennus | 56-64℃ | 3-20s | ||
Laadunvalvonta
1.Toiminnan havaitseminen: qPCR:n herkkyys, spesifisyys ja toistettavuus.
2.Ei eksogeenistä nukleaasiaktiivisuutta: ei eksogeenistä endonukleaasi- ja eksonukleaasisaastetta.
Huomautuksia
1.Nopean DNA-polymeraasin monistusnopeus on vähintään 1 kb/10s.Eri PCR-instrumenteilla on erilaiset lämmitys- ja jäähdytysnopeudet, lämpötilan säätötavat ja lämmönjohtavuus, joten alukkeen/koettimen pitoisuuden ja ajomenetelmän optimointi yhdessä oman nopean PCR-laitteen kanssa on välttämätöntä.
2.Tällä tuotteella on laaja käyttökelpoisuus ja se soveltuu erittäin herkän molekyylidiagnoosin suorittamiseen.Kolmivaiheista PCR-menetelmää suositellaan alukkeille, joiden pariutumislämpötila on alhainen, tai pitkien yli 200 bp:n fragmenttien monistamiseen.
3.Koska eri amplikoneilla on erilainen dUTP:n hyötysuhde ja erilainen herkkyys UNG:lle, reagenssit tulee optimoida, jos havaitsemisherkkyys laskee UNG-järjestelmää käytettäessä.Ota tarvittaessa yhteyttä teknistä tukea varten.
4.Siirtyvien PCR-tuotteiden monistumisen välttämiseksi monistukseen tarvitaan erillinen koealue ja pipetti.Käytä käsineitä ja vaihda niitä usein, äläkä avaa PCR-putkea monistamisen jälkeen.
